三種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的生物活性研究

周潔塵 閆瑞坤 王圣潔 何苑皞 譚益明 周國英

（中南林業科技大學 經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，長沙 410004）

三種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的生物活性研究

周潔塵 閆瑞坤 王圣潔 何苑皞 譚益明 周國英

（中南林業科技大學 經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，長沙 410004）

在室內測定了垂序商陸全草、柚果皮、博落回全草乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的生物活性，并測定了其林間防效。結果顯示，不同濃度3種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲都有一定的生物活性，且濃度越高作用效果越強。柚皮粗提物對松梢螟幼蟲的生物活性最強，100 mg/mL的柚皮粗提物對松梢螟幼蟲的最高毒殺校正死亡率、拒食率、生長抑制率分別為80.00%、99.28%和96.32%，同時其林間防治效果為55.70%，與對照藥劑噻蟲啉的防治效果在同一顯著水平。垂序商陸粗提物對松梢螟幼蟲的生物活性最弱，但其高濃度粗提物校正死亡率仍在70%以上，拒食率以及生長抑制率也在90%以上。

乙醇粗提物 松梢螟 毒殺作用 拒食作用 生長抑制作用

馬尾松（Pinus massoniana）是中國南方地區重要的綠化鄉土造林樹種和用材樹種，經濟價值極高且用途廣泛。馬尾松樹干富含豐富的油脂，是生產松脂的主要樹種［1］；其木材的耐腐性較好，可以應用于多個輕、重工業領域，如建筑、涂料、家具、油漆、造紙、橡膠等［2，3］；枝干可用于人工培養茯苓、松蕈等真菌；花粉可入藥［4］。近幾年來，馬尾松人工造林面積廣，且為追求高額利潤而普遍連栽，導致馬尾松林物種多樣性喪失，蟲害種類繁多且易發生大面積爆發［5］。

松梢螟（Dioryctria splendidella），又名鉆心蟲，可危害馬尾松頂梢及松球，導致主干彎曲，嚴重影

響松樹生長和松材材質以及果實產量。近年來，湖南衡山松林松梢螟為害情況嚴重，且沒有較有效的防治方法。目前防治松梢螟的方法主要是撫育措施結合化學藥劑防治［6］，使用化學藥劑存在殘留量高，對環境污染嚴重等各種弊端。植物殺蟲資源豐富，對環境、植物本身以及害蟲天敵均無影響，也不易使有害生物產生抗藥性［7，8］，所以植物源殺蟲劑成為時下農藥研究開發的熱點。劉海偉［9］研究了菊芋葉片提取物對棉鈴蟲的生物活性，結果表明菊芋葉片乙酸乙酯提取物對棉鈴蟲的生物活性作用最明顯；李云壽等［10］發現紫莖澤蘭對4種儲糧害蟲有一定的生物活性；何靜［11］的研究表明了蒼耳提取物對粘蟲有一定的毒殺作用。博落回、垂序商陸全株有毒，近年來相關殺蟲作用研究逐漸增多［12-14］，周順玉等［15］研究了博落回對茶毛蟲及茶尺蠖的生物作用，何雅薔等［16］測定了垂序商陸對赤擬谷盜和玉米象的作用。柚果皮中含有多種活性成分，具有殺蟲抑菌作用［17］。本實驗室研究發現這3種植物對油茶炭疽病病原菌均具有一定的抑制作用。

國內對于防治松梢螟的植物源藥劑的開發也有初步地研究，有研究表明苦參根中含有對松梢螟幼蟲具有顯著毒殺活性的物質［18］。本研究探索3種植物垂序商陸（Phytolacca americana L.）全草、柚（Citrus maxima）果皮、博落回（Macleaya cordata）全草的乙醇粗提物對松梢螟的3、4、5齡幼蟲的生物活性作用，以期為基于植物源藥劑的松梢螟防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 垂序商陸全草采集于2012年5-8月，地點為湖南省衡陽市衡山縣紫金山林場龍鳳工區旁；柚皮收集于2012年9-12月，為沙田柚廢棄果皮；博落回全草采集于2012年5-8月，地點為湖南省黃豐橋林場。

1.1.2 供試幼蟲 松梢螟幼蟲收集于湖南省衡山市紫金山林場龍泉馬尾松幼林。用廣口瓶作為飼養器，瓶中放入經60℃烘箱2 h消毒的松梢段，瓶口用紗布封好，培養溫度為27℃左右，相對濕度為60%-80%。將松梢螟幼蟲分批接入飼養器中飼養繁殖，取3、4、5齡幼蟲進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 植物的預處理及粗提物的制備 將3種植物洗凈置于陰涼處晾干，然后放在恒溫干燥箱中以60℃的溫度烘干至葉片發脆。小心取出植物用粉碎機粉碎，過40目篩。將獲得干粉稱重后置于密封瓶內保存備用。

采用超聲波提取法［19］進行粗提物的制備，提取溶劑為乙醇。分別稱取適量3種植物干粉，加入10倍體積（V/W）的90%乙醇浸漬1 d，然后置于超聲波細胞粉碎機3℃溫度粉碎振蕩1 h，工作時間為2 s，間隙時間為0.5 s，重復超聲。真空抽濾提取液，棄廢渣，減壓濃縮濾液至恒定重量獲得浸膏狀植物乙醇粗提物。用60%乙醇溶液溶解3種植物粗提物，適量添加0.1%的吐溫-80，分別制成濃度為6.25、12.5、25、50和100 mg/mL的供試溶液。將試驗分3組進行，分別為P.a垂序商陸粗提物各濃度供試液，C.m柚皮粗提物各濃度供試液，M.c博落回粗提物各濃度供試液。

1.2.2 毒殺作用的測定 采用浸漬法［20］。挑選健康、生長狀態體重基本一致的3齡、5齡幼蟲，分別放入不同濃度的植物粗提物中浸漬5 s后取出，設置清水對照及30 mg/mL市售噻蟲啉陽性對照，每個濃度處理10頭幼蟲，3次重復。處理后的幼蟲用無藥新鮮松梢段正常飼養，連續觀察48 h后記錄試蟲死亡頭數，觀察蟲體中毒癥狀及死亡形態，計算校正死亡率。

死亡率（%）=死亡蟲數/總蟲數×100%

校正死亡率（%）=（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100%

1.2.3 拒食作用的測定 將新鮮直徑大小基本一致的馬尾松梢枝條截成20 mm長的小段，分別放入不同濃度3種植物乙醇粗提物和清水中浸泡10 s。待松梢段靜置陰干后用于飼喂松梢螟4齡幼蟲，幼蟲健康且生長狀況基本一致并經過6 h饑餓處理。3種植物粗提物的不同濃度皆處理10頭幼蟲，并重復3次。連續觀察2 d，分別在24 h與48 h時測量試蟲食物攝入量，并計算拒食率［21，22］。

1.2.4 生長抑制作用測定 采用飼喂稱重法［23］。將

直徑大小基本一致的新鮮馬尾松梢枝條截成20 mm長的小段，分別在不同濃度3種植物乙醇粗提物和清水中浸泡10 s。待松梢段靜置陰干后用于飼喂松梢螟4齡幼蟲，幼蟲健康且生長狀況基本一致并經過6 h饑餓處理。3種植物粗提物的不同濃度皆處理10頭幼蟲，并重復3次。用處理松梢段飼喂試蟲48 h后清理飼養器，改換無處理新鮮松梢段飼喂，1 d更換一次，直到試蟲化蛹。于24、48和96 h時稱量試蟲體重。根據試蟲體重變化情況計算生長抑制率［24］。

1.2.5 林間防治效果測定 試驗地點為紫金山林場龍泉村五年生馬尾松幼林樣地。試驗方法為以3 d為一個周期施藥，共施藥12 d，每種植物粗提物施藥15顆馬尾松幼苗，并設置3個重復。同時以清水和標準農藥30 mg/mL噻蟲啉作為對照組。噴灑藥液前調查蟲口基數，分別于施藥后第3天、第7天以及第15天調查幼苗整株上剩余活蟲數，計算馬尾松受害株率和松梢螟幼蟲防治效果［25，26］。

1.2.6 數據分析 用SPSS 18.0和DPS（Data Processing System）數據處理軟件進行數據分析。采用Duncan’s法分析數據差異顯著性。將拒食率、生長抑制率和校正死亡率均轉化為機率值，將濃度進行對數轉換后繪制毒力回歸方程，并計算AFC50、LC50。

2 結果

2.1 3種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的毒殺作用

不同濃度植物粗提物對松梢螟5齡幼蟲的毒殺結果（表1）表明，植物粗提物的濃度越高，其毒殺作用越強。其中柚皮乙醇粗提物對松梢螟5齡幼蟲的毒殺作用較強，在最高濃度100 mg/mL時，其毒殺作用與30 mg/mL噻蟲啉的毒殺作用差異不顯著。而在濃度達50 mg/mL時，3種植物乙醇粗提物對試蟲的毒殺作用均達到了60%以上，說明這3種植物對松梢螟5齡幼蟲都具有一定的毒殺活性。

表1 三種植物乙醇粗提物對松梢螟5齡幼蟲的毒殺作用結果

3種植物乙醇粗提物對松梢螟3齡幼蟲的毒殺作用結果（表2）顯示，柚皮粗提物對松梢螟3齡幼蟲的毒殺作用最為明顯，也與30 mg/mL噻蟲啉的毒殺作用處在同一顯著水平。在最高濃度100 mg/mL時，3種植物粗提物的毒殺作用均達到90%以上；僅在濃度為6.25 mg/mL時，3種植物粗提物處理后的3齡幼蟲校正死亡率達50%以上；3種植物乙醇粗提物對松梢螟3齡幼蟲也具有一定的毒殺活性。

表2 三種植物乙醇粗提物對松梢螟3齡幼蟲的毒殺作用結果

表3顯示，柚皮粗提物對5齡、3齡幼蟲的毒殺中濃度LC50均小于博落回粗提物與垂序商陸粗提物，這說明柚皮粗提物具有更強的毒殺作用，與表1和表2的結果相符合。而表1-表3顯示，3種植物乙醇粗提物對松梢螟3齡、5齡幼蟲均具有一定的毒殺作用，而3齡幼蟲的死亡率高于5齡幼蟲，說明3種植物粗提物對3齡幼蟲的毒殺作用皆優于5齡幼蟲；每種植物粗提物對試蟲毒殺作用的95%置信限皆不重疊，也說明3種植物粗提物對松梢螟3齡幼蟲的毒殺與對5齡幼蟲的毒殺作用差異顯著。

表3 三種植物乙醇粗提物對松梢螟5齡、3齡幼蟲的毒殺毒力分析

2.2 3種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的拒食作用

表4中結果表明，3種植物粗提物對松梢螟4齡幼蟲都有一定的拒食活性，且拒食活性隨粗提物濃度的升高而增強。其中，濃度為100 mg/mL的柚皮粗提物對松梢螟幼蟲的拒食作用在24 h時達到99.28%，試驗中幼蟲在前24 h基本不取食柚皮粗提物處理的松梢段。而在48 h后，3種植物粗提物100 mg/mL濃度對松梢螟幼蟲的拒食作用在90%以上且處于同一顯著水平，3種植物粗提物均表現出較強的拒食活性，這說明粗提物中拒食作用有效成分在48 h后仍有較強的作用。

表4 三種植物乙醇粗提物對松梢螟4齡幼蟲的拒食作用結果

表5 三種植物乙醇粗提物對松梢螟4齡幼蟲的拒食作用毒力分析

通過拒食作用毒力（表5）分析可知，柚皮乙醇粗提物的拒食中濃度相較而言最低，拒食作用效果最好，且48 h和24 h的95%置信限重復較大，說明48 h與24 h的拒食作用效果差異不顯著。垂序商陸乙醇粗提物與博落回乙醇粗提物的95%置信限

同樣也表現出這點。

表6 三種植物乙醇粗提物對松梢螟4齡幼蟲的生長抑制作用結果

2.3 3種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的生長抑制作用

表6顯示，不同濃度3種植物乙醇粗提物均能在一定程度上抑制松梢螟4齡幼蟲的生長，生長抑制作用隨濃度的增加而增強。其中濃度100 mg/mL柚皮粗提物抑制作用最為明顯，生長抑制率在處理24 h后達96.32%；而濃度100 mg/mL垂序商陸粗提物與博落回粗提物對松梢螟幼蟲的生長抑制率略低于柚皮提取物，但與之相比仍處于同一顯著水平。

表7 三種植物乙醇粗提物對松梢螟4齡幼蟲的生長抑制作用毒力分析

經毒力分析發現，3種植物乙醇粗提物對松梢螟4齡幼蟲的生長抑制作用效果沒有隨時間推移而減弱。從表6和表7中可以看出，3種植物粗提物在24 h后對松梢螟幼蟲的生長抑制作用較96 h后強，但96 h后生長抑制率仍有90%以上，說明3種植物粗提物中的有效成分代謝半衰期較長，可以長時間保持作用效果，而其95%置信限的重疊現象也說明了這點。

2.4 3種植物乙醇粗提物林間防治效果測定

從表8可知，濃度為100 mg/mL的3種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的防治均有一定效果，其中柚皮乙醇粗提物對松梢螟幼蟲的林間防治效果最好，與標準農藥噻蟲啉作用效果相當。

3 討論

目前，由于環境的不斷惡化，化學藥劑對環境的影響嚴重，人們越來越多地致力于從天然產物中

提取活性物質來進行病害或蟲害的防治［27，28］。植物的抑菌殺蟲作用是長期與昆蟲和病原菌進化產生的結果，主要依賴于植物的次生代謝產物［29］。本試驗中3種植物對松梢螟幼蟲的毒殺作用較好且作用效果持續時間較長，這說明3種植物中殺蟲活性成分可以被乙醇提取出來，且活性成分代謝半衰期較長。本試驗毒殺作用的測定采用的浸蟲法，蟲體浸入藥液后，藥液可能通過口器進入消化道、也可能通過氣門等進入蟲體，因此毒殺作用是觸殺、胃毒、熏蒸等多種作用的綜合結果。而本試驗僅測試了拒食作用及生長發育作用，并不能說明有效成分的具體作用方式。

表8 三種植物乙醇粗提物對松梢螟蟲害的林間防治效果

植物的不同部位含有的有效成分不同，且不同的有效成分提取方法與提取溶劑不盡相同［30-32］，本試驗只研究了3種植物的乙醇提取物，且均為粗提物，其有效成分復雜，為了解對松梢螟幼蟲起到生物作用的主要成分、附效成分及相互間的作用效果，有必要對高活性物質分離純化，分析其活性及化學成分。在毒殺作用測定過程中，3齡幼蟲的死亡率明顯高于5齡幼蟲，這可能是由于幼蟲處在不同的發育階段，其代謝速率、抗藥性等不同所導致的，具體殺蟲機理也值得深入研究。

3種植物對松梢螟幼蟲均具有較強生物活性，有潛力發展成植物源藥劑，然而博落回、垂序商陸全株有毒，如果開發成植物源藥劑還必須評估其對人畜以及天敵等是否安全。

4 結論

本試驗從垂序商陸全草、柚果皮以及博落回中提取有效物質來進行松梢螟幼蟲的防治，結果表明，這3種植物乙醇粗提物對松梢螟幼蟲均有一定的生物活性，柚皮對松梢螟幼蟲的毒殺作用、拒食作用以及生長抑制作用最強，且具有一定的林間防治效果。如開發成植物源農藥，對于林業害蟲的無公害防治具有一定的現實意義。

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（責任編輯 馬鑫）

Bioactivities of the Alcohol Extracts from Three Plants Against Dioryctria splendidella Larvaes

Zhou Jiechen Yan Ruikun Wang Shengjie He Yuanhao Tan Yiming Zhou Guoying
（Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees（Central South University of Forestry and Technology），Ministry of Education，Changsha 410004）

In order to study the bioactivities of ethanol extracts from Phytolacca americana, Citrus maxima peels and Macleaya cordata against the larvaes of Dioryctria splendidella preliminarily in laboratory, contact toxicity, antifeedant activities and body weight gains of D. splendidella larvaes were determined after treated with 3 ethanol extracts. The results indicated that 3 ethanol extracts with different concentration had some bioactivities against the larvae of D. splendidella, and the higher the extracted concentrations, the more obvious of the bioactivities to the larvaes were. When the concentration of Citrus maxima peels extracts was 100 mg/mL, there were the strongest bioactivities. The contact toxicity corrected mortality, antifeedant rate and growth inhibiting rate reached to 80.00%, 99.28%, and 96.32%, respectively. The control effect in the forest was 55.70%, the same as the pesticides thiacloprid. The ethanol extracts from Phytolacca americana had the lowest bioactivities, but the corrected mortality of ethanol extracts being high concentration were more than 70%, antifeedant rates and growth inhibiting rates were more than 90%.

Ethanol extracts Dioryctria splendidella Contact toxicity Antifeedant activities Growth inhibition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.020

2014-04-21

林業公益性行業科研專項經費項目（201004014）

周潔塵，女，碩士研究生，研究方向：病蟲害無公害防治技術；E-mail：244756681@qq.com

周國英，博士，教授，研究方向：森林保護及森林微生物；E-mail：guoying_zhou66@163.com