核桃青皮廢棄物中木霉菌的分離及其適應(yīng)性研究

楊衛(wèi)民 冉翠香 高興盛 師亞波 趙林芳

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，呂梁 033001）

核桃青皮廢棄物中木霉菌的分離及其適應(yīng)性研究

楊衛(wèi)民 冉翠香 高興盛 師亞波 趙林芳

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，呂梁 033001）

核桃果實采摘及加工過程中產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)的青皮遺棄物問題已經(jīng)引起社會的關(guān)注。以核桃青皮為原料，濕熱滅菌（溫度121℃，時間30 min）后讓其自然霉變，從中分離出滋生菌株，結(jié)合反證試驗獲得優(yōu)勢菌種。并通過檢測霉變前后青皮中主要營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化對該菌種的適應(yīng)性等進行研究。結(jié)果顯示，從核桃青皮中分離出4株菌株，經(jīng)鑒定分別為黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）和木霉（Trichoderma spp.），其中木霉屬菌株是優(yōu)勢菌種。霉變前后青皮營養(yǎng)物質(zhì)變化情況為可溶性糖、脂肪、蛋白質(zhì)和纖維素含量分別減少了6.03%、2.97%、7.68%和64.7%。木霉菌對核桃青皮有良好的適應(yīng)性和分解效果，可開發(fā)為生物肥料和新型生物殺菌劑。

核桃青皮 優(yōu)勢菌種 木霉菌 生物殺菌劑

核桃屬于胡桃科核桃屬落葉喬木，學(xué)名胡桃（Juglans regia L.）。我國核桃資源豐富，栽培歷史長達兩千多年，山西、河北、河南、山東、陜西、甘肅、青海及新疆南部多有栽培。目前，我國核桃種植面積達到3 175萬hm2，產(chǎn)量近50萬t，種植總面積、產(chǎn)量居世界第一位。然而，核桃果實采收后，如果大量的青皮在田間、地頭或溝邊堆放，會嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境，危及動植物的生存［1］。如果對其加以利用，不僅可以防止環(huán)境污染，還可以增加果農(nóng)的經(jīng)濟收入。

核桃青皮為核桃外部的一層厚厚的綠色果皮，俗稱“青龍衣”。青龍衣苦、澀、平，古代諸家多以其清熱解毒、祛風(fēng)療癬、止痛止痢功效入藥［2］。現(xiàn)代研究表明，核桃青皮中每種有機化合物成分的作

用各有不同，經(jīng)過溶劑浸提所得混合物可直接用于制作藥物、提取色素及制做農(nóng)藥等方面［3］。自1985年許紹惠等［4］首次從胡桃青皮廢棄物中分離提純出胡桃醌以來，國內(nèi)外對胡桃青皮的化學(xué)成分研究取得了一定的進展。研究顯示，胡桃果皮中化學(xué)成分有39種揮發(fā)油和7種脂肪酸，結(jié)果顯示揮發(fā)油占79.09%、脂肪酸占19.02%，其中的揮發(fā)油有烴類（26種、71.80%）、酮類（3種、10.83%）、醇類（6種、7.96%）、呋喃類（1種、5.79%）、酚類（1種、1.99%）、肟類（1種、0.95%）、酯類（1種、0.71%）七大類化合物。目前，國內(nèi)外對胡桃青皮成分以及在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等方面的研究已經(jīng)有較多的報道。但在自然條件下，核桃青皮是如何被土壤微生物分解、轉(zhuǎn)化的研究未曾見報道。本研究以核桃青皮為原料，高溫處理后讓其自然霉變，從中分離出滋生菌株，結(jié)合反證試驗獲得優(yōu)勢菌種，并通過檢測霉變前后青皮中主要營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化對該菌種的適應(yīng)性等進行研究，旨在為利用木霉菌開發(fā)為生物肥料和新型生物殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 核桃青皮取于呂梁本地。

1.1.2 試劑 濃硫酸、無水乙醇、乙酸、乙酸乙酯、葡萄糖、纖維素、氫氧化鈉、石油醚（以上均為分析純）、濃磷酸、95%乙醇、考馬斯亮藍G250、蒽酮、牛血清蛋白、30%過氧化氫、瓊脂粉、馬鈴薯。真菌 DNA 提取試劑盒、UNIQ-10 柱式 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、100 bp plus DNA ladder buffer、2×Taq PCR MasterMix、MgCl2、ITS1、ITS4、pMD18-T vector、10×Ligation Buffer、50% PEG4000、T4 DNA ligase、質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒，均購于上海生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）、SHB-III A循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、DZF-3型真空干燥箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）、KA-1000型離心機（北京譜析通用儀器有限公司）、VIS-723N可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）、SZF-06A粗脂肪測定儀（上海新嘉電子有限公司）、DFY-5/40低溫恒溫反應(yīng)浴（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、SPX-80生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）、FM-智能生化培養(yǎng)箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）、XH300B-微波超聲波組合合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）、LDZX-40Ⅱ-立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、SMART-生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離純化、鑒定和染菌 青皮處理：取核桃青皮于通風(fēng)處陰干至材料發(fā)脆，放入恒溫箱內(nèi)（40-45℃）烘干，磨碎，過100目篩，裝入玻璃容器中備用。

1.2.1.1 菌種自然培養(yǎng) 取5 g核桃青皮粉于5個培養(yǎng)皿中，分別加入一定量的超純水，振蕩，至膏狀。于28℃恒溫培養(yǎng)1-4周，直至有菌發(fā)生為止。

1.2.1.2 菌種分離純化 取馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，純凈水1 000 mL，pH自然。培養(yǎng)基經(jīng)121℃、30 min滅菌。冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。挑取的微生物單菌落，移到PDA培養(yǎng)基上，于28℃生化培養(yǎng)箱中恒溫倒置培養(yǎng)5-7 d，期間不斷進行菌落、菌體形態(tài)鏡檢觀察。若菌落菌體不純，混有雜菌時可將平板上長出的菌落上的孢子，用接種針挑取少許再轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至菌體純化為止，以便于觀察菌落、菌體形態(tài)，進行分類鑒定［5］。已純化的菌種4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 菌種形態(tài)觀察 分別用于肉眼和顯微鏡直接觀察平板上所占的菌落大小、顏色、質(zhì)地疏松程度、外觀生長狀況等。取載玻片加純水一滴（若所觀察菌體無色，則滴加染液），用接種針挑取一小塊微生物培養(yǎng)物，置于純水中，用兩支接種針將培養(yǎng)物撕成小塊，然后加蓋玻片。如有氣泡，可在酒精燈上加熱排除。此操作應(yīng)在接種箱內(nèi)進行，以免孢子飛揚。顯微鏡下觀察菌體的菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)、孢子產(chǎn)生方式和排列特征等。根據(jù)菌落菌體形態(tài)觀察結(jié)果，以《真菌鑒定手冊》［6］和《常見與常用真菌》［7］中的描述對分離純化出的微生物進行初步鑒定。

1.2.1.4 菌種ITS序列測定 菌種總DNA 提取：

取培養(yǎng)5 d后的菌絲，用CTAB 法提取和純化基因組DNA。rDNA ITS的擴增與序列測定：采用引物ITS1/ITS4進行擴增，PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，反應(yīng)液為：BSA 2.5 μL；10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl225 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.8 μL，5 U/μL Taq酶0.15 μL，模板DNA 3 ng，引物 ITS1 和 ITS4各1 μL（25 μmol/L），加ddH2O 總體積達到12.05 μL后進行擴增。擴增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后 72℃延伸10 min。序列測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。rDNAITS序列在NCBI網(wǎng)站（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）中的相關(guān)序列的 ITS 區(qū)進行同源性比較。

1.2.1.5 核桃青皮培養(yǎng)基的制備［8］將已經(jīng)過表面滅菌的培養(yǎng)皿中分別加入5 g備用的核桃青皮，加一定量的超純水，將之制成膏狀。以25 g為一組放入高壓蒸汽滅菌器中，121℃、30 min滅菌。將已滅菌培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，若無菌生長，則放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.6 菌懸液制備 將分離純化得到的各菌株編號，然后分別接種在液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.1.7 核桃青皮培養(yǎng)基染菌 將制備的菌懸液污染無菌核桃青皮培養(yǎng)基，每菌株制作6組，并設(shè)一對照組，之后，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察培養(yǎng)皿中是否出現(xiàn)原接種的菌株。

1.2.2 青皮培養(yǎng)基化學(xué)成分的測定

1.2.2.1 可溶性糖含量的測定（蒽酮比色定糖法）標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：蒽酮試劑（2 g蒽酮溶于1 000 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的硫酸中，當(dāng)日配制使用），標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）（表1），沸水浴中煮沸10 min，取出，自來水冷卻，室溫放置10 min，620 nm處比色。

表1 蒽酮比色定糖法標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑的制備

樣液的制備：稱取備用核桃青皮2 g加入蒸餾水50 mL超聲波微波輔助提取，溫度80℃，微波功率400 W，提取時間9 min（間歇處理：處理3 min，冷卻3 min），然后，將樣液經(jīng)4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液抽濾，將濾液定容至100 mL，備用［9］。

樣品含量的測定：精密量取4 mL供試溶液5份，分別置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻。分別精密量取上述溶液1 mL于具塞試管中，置于冰水浴中5 min，并分別加入蒽酮試劑4 mL，然后在沸水浴中加熱10 min，之后用自來水冷卻。以蒸餾水加蒽酮試劑為對照，在波長620 nm處測定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中糖的含量。

1.2.2.2 青皮培養(yǎng)基脂肪含量的測定（Soxhlet抽提法） 將洗凈的抽提瓶用鉛筆在磨口處編號，103-105℃烘2 h，取出后置于干燥器內(nèi)冷卻、稱重，并記為A。取1 kg核桃青皮103-105℃烘2 h，取出后置于干燥器內(nèi)冷卻備用。稱取干樣1 g，裝入事先準(zhǔn)備的濾紙包中，脫脂棉線包好，置于抽提器底部。在抽提瓶內(nèi)加入石油醚，恒溫水浴加熱回流8 h。水浴溫度控制在70-80℃（以120-150滴/min為宜）。提取完畢，收集石油醚，置103-105℃烘箱中烘30 min，冷卻至室溫，稱重，并記為B。由抽提瓶增加之重量計算樣品的脂肪含量。

1.2.2.3 青皮培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：0.9% NaCl溶液，標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（0.1 mg/mL牛血清蛋白），考馬斯亮藍G250（0.01%）（表2），搖勻，室溫靜置3 min，于波長595 nm處比色。樣液的制備：稱取備用核桃青皮干燥樣品0.5 g加少量石英砂用0.9% NaCl溶液研磨成勻漿定容至100 mL，靜置10-30 min（3-5 min搖動1次）后過濾（加活性炭脫色），濾液定容至100 mL備用［10］。樣品含

量的測定：分別精密量取1 mL供試溶液及4.0 mL考馬斯亮藍染液于5支試管中，搖勻，室溫靜置3 min，于波長595 nm處測定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

表2 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑的制備

1.2.2.4 青皮培養(yǎng)基纖維素含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：0.1 mg/mL纖維素標(biāo)準(zhǔn)液，2%蒽酮，濃硫酸（表3），搖勻，靜置12 min，620 nm處比色。核桃青皮纖維素獲取：精確稱取5 g核桃青皮粉于磨口錐形瓶中，按料液比1∶20（m/V）加入已調(diào)至pH1.5的蒸餾水，置85℃的水浴鍋中不斷攪拌，提取2.5 h，2層紗布抽濾，濾渣用pH1.5的蒸餾水洗滌3次，保留濾渣。將濾渣按料液比1∶20浸于6%的氫氧化鈉中，室溫條件下放置20 h，適當(dāng)攪拌。將浸泡過的物料過濾，濾渣洗至中性。然后加等量10%過氧化氫溶液并用50%乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5-5.0，30℃恒溫放置30 min，冷卻至室溫過濾。將所得濾渣水洗至中性，再用50%酒精洗滌，60℃干燥，得纖維素［11］。

樣液的制備：準(zhǔn)確稱取纖維素0.2 g于燒杯中，置于冷水浴中，加入60% H2SO4溶60 mL，并消化30 min，然后將消化好的纖維素溶液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，用60% H2SO4定容至刻度，搖勻后用布氏漏斗過濾。

樣液的測定：取上述濾液5 mL放入100 mL容量瓶中，在冷水浴上加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后使用。分別精確量取溶液2 mL于5支具塞試管中，再分別加0.5 mL 2%蒽酮試劑，并沿試管壁加5 mL濃H2SO4，塞上塞子，搖勻靜置12 min，然后在620 nm波長下測吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中纖維素的含量。

2 結(jié)果

2.1 青皮中微生物種類特征

從核桃青皮中分離純化得到4株菌株，分別編號為HTQP-1、HTQP-2、HTQP-3、HTQP-4。4株菌株的共同特征是菌落干燥、大而疏松或大而致密、不透明，菌落顏色各不相同，在PDA培養(yǎng)基上菌落正反面顏色不同，細(xì)胞生長速度較快。

表3 纖維素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑的制備

2.1.1 核桃青皮微生物的形態(tài)學(xué)特征 核桃青皮微生物的分離純化后，將其菌種保存于PDA培養(yǎng)基，并對菌株的菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)的觀察和記錄（表4，圖1）。

2.1.2 菌種鑒定 根據(jù)菌株培養(yǎng)特性、形態(tài)特征及ITS 基因序列同源性對比等進行綜合分析，參考有關(guān)資料認(rèn)為HTQP-1為黃曲霉，HTQP-2為青霉，HTQP-3為黑曲霉，HTQP-4為木霉。具體情況見表5。

2.1.3 青皮微生物反證試驗結(jié)果及分析 將上述4株菌株進行微生物反證試驗，結(jié)果（表6）顯示。黃曲霉（HTQP-1）、青梅（HTQP-2）、黑曲霉（HTQP-3）和木霉（HTQP-4）菌株均在青皮培養(yǎng)基上出現(xiàn)，說明這4株菌株不是污染性的雜菌，但每種菌株出現(xiàn)時間和生長速度差異明顯。結(jié)合它們在青皮培養(yǎng)基上的生長狀況，可判斷木霉（HTQP-4）是核桃青皮微生物中的優(yōu)勢菌種（圖2）。

2.1.4 基于核桃青皮培養(yǎng)基的木霉菌培養(yǎng) 木霉菌在核桃青皮培養(yǎng)基上生長迅速，4 d后有一般菌絲轉(zhuǎn)綠，6 d后全部菌絲轉(zhuǎn)綠，布滿培養(yǎng)皿，菌絲末端產(chǎn)生大量的綠色孢子（圖3）。本次培養(yǎng)的木霉菌純度，長勢都較好，便于常規(guī)方法進行擴繁及保存。

表4 PDA培養(yǎng)基上菌落及菌體形態(tài)

圖1 HTQP-1（A）、HTQP-2（B）、HTQP-3（C）和HTQP-4（D）的菌落及菌體

表5 核桃青皮微生物的初步鑒定

圖2 核桃青皮培養(yǎng)基上的HTQP-4

表6 核桃青皮微生物反證試驗結(jié)果

2.2 優(yōu)勢菌種青皮培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的測定

2.2.1 可溶性糖含量測定結(jié)果及分析 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示；樣品可溶性總糖含量測定結(jié)果見表7；試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基總糖濃度的差值平

均值為0.193 0 mg/mL，試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基總糖含量差值（H）為6.03%。

圖3 木霉菌在核桃青皮培養(yǎng)基生長情況

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表7 樣品可溶性總糖含量

2.2.2 脂肪含量測定結(jié)果及分析 樣品脂肪含量測定結(jié)果（表8）顯示，試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基脂肪含量差值平均值為0.029 7 mg/mL，試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基脂肪含量差值（H）為2.97%。

表8 樣品脂肪含量

2.2.3 可溶性蛋白質(zhì)含量測定 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示；樣品蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果（表9）表明，試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量差值平均值為0.384 0 mg/mL，試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量差值（H）為7.68%。

表9 樣品蛋白質(zhì)含量

2.2.4 纖維素含量測定 纖維素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示；樣品纖維素含量測定結(jié)果（表10）表明，試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基纖維素濃度差值平均值為0.0647 mg/mL，所以試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基纖維素含量差值（H）為64.7%。

表10 樣品纖維素含量測定結(jié)果

3 討論

根據(jù)菌株培養(yǎng)特性、形態(tài)特征及ITS 基因序列

同源性對比等進行綜合分析，參考有關(guān)資料認(rèn)為，HTQP-1為黃曲霉、HTQP-2為青霉、HTQP-3為黑曲霉和HTQP-4為木霉，利用反證試驗法證實木霉（HTQP-4）是核桃青皮微生物中的優(yōu)勢菌種。目前對微生物的生物學(xué)鑒定主要依據(jù)各分類單位在分化特征和形態(tài)特征上的異同點［12］。但同一屬不同種的形態(tài)往往又極其相似，難以區(qū)分。不同的用途要求對菌種需要精確的分類和鑒定，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法很難適用于此。近年來研究工作者廣泛運用包括等位酶技術(shù)、RAPD、AFLP、UP-PCR、DNA指紋和序列分析技術(shù)在內(nèi)的分子生物學(xué)方法，通過比較菌株間DNA序列的相似性程度，可對微生物的種進行精確歸類和分析［13］。

圖5 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 纖維素標(biāo)準(zhǔn)曲線

培養(yǎng)前后核桃青皮可溶性糖、脂肪、蛋白質(zhì)和纖維素含量分別減少6.03%、2.97%、7.68%和64.7%，與4種菌種存在密切的關(guān)系。根據(jù)培養(yǎng)前后核桃青皮有機物質(zhì)變化情況來看，變化依大小排列為纖維素＞蛋白質(zhì)＞可溶性糖＞脂肪，比較4種菌種對纖維素的分解能力可作為選擇優(yōu)勢菌種的一個重要依據(jù)。4個菌種中黃曲霉和青霉不具備對纖維素的分解能力，可直接排除。黑曲霉和木霉具有分解纖維素的能力，在對比黑曲霉和木霉培養(yǎng)特點和形態(tài)特征時發(fā)現(xiàn)，整個核桃青皮培養(yǎng)基中主要是木霉，因此可初步確定木霉為優(yōu)勢菌種。文獻記載木霉具有較強分解纖維素能力，其中綠色木霉通常能夠產(chǎn)生高度活性的纖維素酶，對纖維素的分解能力很強。在木質(zhì)素、纖維素豐富的基質(zhì)上生長快，傳播蔓延迅速，這與本研究結(jié)果也相一致。

木霉菌廣泛存在于土壤、空氣、和植物體表面等生態(tài)環(huán)境中，是一種重要的生防菌。據(jù)報道，目前國際上已有50多種木霉菌的不同制劑作為生物農(nóng)藥或生物肥料進行了登記［14］。其中木霉菌以生物肥料的形式注冊相對容易［15］，可同時應(yīng)用于多種病害的生物防治，還能兼顧對作物生長的促進和土壤環(huán)境的修復(fù)。如果以木霉菌作菌種，可將核桃青皮開發(fā)為生物肥料，不僅可以解決大量核桃青皮造成的環(huán)境污染，而且可以帶來一定的經(jīng)濟利益。

4 結(jié)論

引起核桃青皮自然霉變的菌種分別是黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）和木霉（Trichoderma spp.），其中木霉（Trichoderma spp）是優(yōu)勢菌種。

核桃青皮霉變前后營養(yǎng)物質(zhì)變化情況為；纖維素、蛋白質(zhì)、可溶性糖和脂肪含量分別減少了64.7%、7.68%、6.03%和2.97%。

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［14］陳捷.木霉菌在植物病害生物防治中的作用機理研究進展［C］.楊懷文.邁入二十一世紀(jì)的中國防治. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社.2005.70-76.

［15］陳捷, 朱潔偉, 張婷, 等.木霉菌生物防治作用機理與應(yīng)用研究進展［J］.中國生物防治學(xué)報, 2011, 27（2）：145-151.

（責(zé)任編輯 李楠）

Research on Isolation of Trichoderma from Waste of Walnut Peel and Adaptability

Yang Weimin Ran Cuixiang Gao Xingsheng Shi Yabo Zhao Linfang
（Department of Life Science，Lüliang University，Lüliang 033001）

The peel derelict of hazardous substances from walnut fruit picking and processing has given a rise to the concern around the world. Walnut peel was used as the raw material and was left to mildew after its moist heat sterilization（temperature 121℃, 30 min）treatment, and then breeding strains were isolated from the walnut peel. The dominant species were to be gained through disproveal experiments, and adaptability of the species through detection changes in the main nutrient content of the peel around the mildew was researched . The results showed that the four walnut strains were isolated, which fall into Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium and Trichoderma. Trichoderma strains is the most dominant strain among all the strains. The change of peel nutrients after mildew as follows：soluble sugar content decreases by 6.03%, fat content decreases by2.97%；proteins decreases by 7.68%, cellulose content decreases by 64.7%. In a conclusion, Trichoderma is adaptable to walnut peel and has decomposition effects, and can be developed as a new bio-fertilizers and biocides.

Walnut peel Dominant strain Trichoderma Biological fungicide

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.025

2014-03-12

山西省教育廳高校科技研究開發(fā)項目和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目（201206），山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（2013380），呂梁學(xué)院自然科學(xué)校內(nèi)基金項目（ZRXN201311），呂梁學(xué)院校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（CXCYZD201312）

楊衛(wèi)民，男，教授，研究方向：植物資源可持續(xù)開發(fā)與利用；E-mail：yangweimin0318@sina.com