產(chǎn)β-淀粉酶菌株的篩選及β-淀粉酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)

李猛 陳利飛 楊建樓 馬春玲

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250000）

產(chǎn)β-淀粉酶菌株的篩選及β-淀粉酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)

李猛 陳利飛 楊建樓 馬春玲

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250000）

從淀粉廠附近的土壤中篩選到一株能夠利用淀粉的細(xì)菌，對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)和16S rDNA同源性比對(duì)，分析該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。利用基因克隆技術(shù)得到了該菌株的β-淀粉酶基因，該基因含有一個(gè)約30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。將該β-淀粉酶基因重組進(jìn)入質(zhì)粒pET-28a中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。檢測(cè)表達(dá)結(jié)果顯示得到了重組后的β-淀粉酶蛋白質(zhì)，重組酶的酶活力提高了53.9%。

β-淀粉酶 蠟狀革孢桿菌 克隆 表達(dá)

β-淀 粉 酶（1，4-α-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2）與α-淀粉酶不同，它是一種外切型糖化酶，從淀粉的非還原性末端依次切下一個(gè)麥芽糖單位［1，2］。在小麥、甘薯、大豆和大麥等高等植物體中普遍存在β-淀粉酶，雖然細(xì)菌中大都含有α-淀粉酶，但含有β-淀粉酶的細(xì)菌并不是很多，Higashihara等［3］首次在巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）中發(fā)現(xiàn)了β-淀粉酶，之后研究人員又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了幾種產(chǎn)孢子的革蘭氏陽性菌也能夠產(chǎn)生β-淀粉酶，如蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［4，5］、多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、高溫放線菌（Thermeoactinomyces sp.）、熱硫梭菌（Clostridium thermosulfurogenes）［6，7］和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）［8］。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有些微生物能夠產(chǎn)生β-淀粉酶，但這些細(xì)菌關(guān)于β-淀粉酶的基因數(shù)據(jù)并沒有研究透徹。

β-淀粉酶的應(yīng)用非常廣泛，利用β-淀粉酶可進(jìn)行麥芽糖的生產(chǎn)，麥芽糖在食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)保健方

面都具有重要用途；β-淀粉酶可促進(jìn)啤酒的糖化進(jìn)程，降低生產(chǎn)成本［9，10］；也可應(yīng)用于工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域［11］。然而，目前工業(yè)生產(chǎn)所用的β-淀粉酶大都是利用植物提取的方法得到，價(jià)格較貴，限制了β-淀粉酶的應(yīng)用，因此篩選得到一株具有β-淀粉酶基因的菌株，并將該基因克隆至適合工業(yè)化生產(chǎn)的宿主菌中，使其能夠代替植物來源的β-淀粉酶顯得尤為重要。

本研究從淀粉廠附近的土壤中，分離到一株能夠利用淀粉的革蘭氏陽性菌D4，并對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)方面的鑒定，初步認(rèn)為該菌株是一株Bacillus cereus。利用克隆技術(shù)得到該菌株的β-淀粉酶基因完整的基因序列，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，得到β-淀粉酶的基因工程菌，對(duì)它的酶活力進(jìn)行分析，旨在為得到高產(chǎn)β-淀粉酶的基因工程菌提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 受體菌大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-28a都為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、EasyPfu DNA Polymerase和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶、Taq DNA聚合酶以及提純和膠回收試劑盒和Ni-NTA購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。引物合成和基因測(cè)序也由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 篩菌樣品來源 篩菌所用土樣來源于濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)淀粉廠附近的土壤。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)β-淀粉酶菌株的初篩 稱取5 g土樣，放入裝有45 mL無菌水的三角瓶中，震蕩20 min后靜置5 min，從中吸取1 mL置于事先滅好菌的試管中，再加入9 mL無菌水，并進(jìn)行梯度稀釋至10-6待用。分別在10-4、10-5和10-6濃度下各取1 mL土壤稀釋液制成混菌平板，將培養(yǎng)皿放入37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在長(zhǎng)出的菌落上滴加碘液，挑取有明顯水解圈的單菌落，進(jìn)行斜面培養(yǎng)、保存。

1.2.2 產(chǎn)β-淀粉酶菌株的復(fù)篩 從斜面上取菌落接入50 mL LB培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃ 培養(yǎng)過夜。將菌液轉(zhuǎn)接到含有2%的直鏈淀粉的液體LB培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃ 培養(yǎng)過夜。對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心、過濾膜處理后，進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析糖成分，以含有2%的直鏈淀粉的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.3 菌落的特征觀察和16S rDNA鑒定 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)得到的細(xì)菌進(jìn)行菌落特征的鑒定。對(duì)得到的菌株進(jìn)行培養(yǎng)后，利用試劑盒提取DNA。并以細(xì)菌16S rDNA通用引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃補(bǔ)充延伸10 min。擴(kuò)增完成后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將擴(kuò)增結(jié)果送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，并進(jìn)行同源性分析，利用軟件MEGA5.2進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建。基于16S rDNA的高度保守性，通過測(cè)序，與基因庫中已有的菌種的16S rDNA序列進(jìn)行同源比對(duì)，可判斷待測(cè)菌的種屬類別［12］。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)已公布的β-淀粉酶基因與NCBI比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)合成上下游引物：上游，5'-CGCGGATCCATGAAAAATCAGTTTCAATATTGTTGTATTGTTGTTTTG-3'；下游，5'-CCGCTCGAGTTACCACCAACTTACATGAGAGGTAGTCTTCAT-3'。其中劃線部位分別為BamH I和Xho I 酶切位點(diǎn)。以所得β-淀粉酶菌株D4的基因組為模板，用EasyPfu DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)30次；72℃補(bǔ)充延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物及濃度。將擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行純化、雙酶切，并與同樣經(jīng)過雙酶切的表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行連接反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒pETBA。將重組質(zhì)粒pET-BA轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)Kan抗性篩選、菌落PCR篩選得到克隆菌株E.coli BL21（pET-BA）。

1.2.5 重組蛋白的表達(dá) 取構(gòu)建的E.coli BL21（pETBA）甘油保藏菌種500 μL接入含有50 μg/mL Kan的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。菌液轉(zhuǎn)接

入另一含有50 μg/mL Kan的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)7 h（達(dá)到菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)中后期），添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），25℃ 180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，收集到的菌體用pH7.4的1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液15 mL重懸菌體，超聲破碎，超聲功率300 W，間歇時(shí)間6 s，破碎時(shí)間5 s，全程時(shí)間12 min。破碎后離心收集菌體，對(duì)上清液進(jìn)行濃縮并SDS-PAGE分析。

1.2.6 Ni-NTA 親和層析 從4℃冰箱中取出保存的鎳柱，重懸填料并靜置使填料完全下沉到柱子的底部，將柱內(nèi)酒精溶液放出。加入5-10倍柱體積的Ni-Native-0緩沖液平衡填料，控制流速1 mL/min；加入1.2.5的大腸桿菌裂解液，保持30 min，控制流速1 mL/min，收集流出液；用5-10倍柱體積的Ni-Native-50緩沖液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；用5-10倍柱體積的Ni-Native-100緩沖液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；用5-10倍柱體積的Ni-Native-250緩沖液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；加5-10倍柱體積的Ni-Native-0緩沖液平衡柱子，并用30%的乙醇溶液保存填料，對(duì)收集到的酶液樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 糖成分分析 以2%的直鏈淀粉溶液為底物與所得粗酶液在50℃反應(yīng)24 h，高速離心，取上清進(jìn)行0.22 μm濾膜過濾，過濾后的上清液進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)糖成分。

2 結(jié)果

2.1 菌株的初步篩選

從淀粉廠附近的土壤中取得5份土樣，每個(gè)樣品中分離到10株能夠利用淀粉的菌株，都有不同程度大小的透明圈出現(xiàn)（圖1），以得到的這50株能夠產(chǎn)生透明圈的菌株為基礎(chǔ)，進(jìn)行復(fù)篩。

圖1 菌株初篩結(jié)果

2.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

以含有2% 直鏈淀粉的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)后的培養(yǎng)液上清液進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）分析培養(yǎng)基的麥芽糖含量。結(jié)果顯示大多數(shù)菌株都能夠產(chǎn)生麥芽糖（43株菌），但其中A2、D4、E7三株菌產(chǎn)生的麥芽糖含量較其他菌株要高，麥芽糖含量分別為9.74，9.98和9.36 g/L三株菌培養(yǎng)基糖含量測(cè)定見圖2，以麥芽糖含量最高者D4菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

2.3 菌落形態(tài)觀察

在普通固體LB培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，顯微鏡檢測(cè)（圖3），菌落形狀近似圓形，白色（似蠟燭顏色），直徑5-7 mm，菌落較軟，表面粗糙。通過顯微鏡觀察，該菌株呈桿狀，無莢膜。

2.4 菌株的生理生化鑒定結(jié)果

根據(jù)菌體的形態(tài)觀察，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，菌株D4為革蘭氏陽性，V-P反應(yīng)呈陽性、不產(chǎn)生吲哚、與甲基紅反應(yīng)呈陰性，與葡萄糖和蔗糖反應(yīng)呈陽性，與乳糖反應(yīng)呈陰性，并可同時(shí)消化淀粉和糊精。

2.5 16S rDNA鑒定結(jié)果

將得到的D4菌株的16S rDNA序列進(jìn)行Blast，并與同源性高的菌株利用軟件MEGA5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4）表明，目標(biāo)菌株D4與Bacillus cereus strain JBE0011的遺傳距離最近，同源性最高，且 D4與 Bacillus cereus strain JBE0011的 16S rDNA的同源性為99%。因此認(rèn)為篩選到的D4菌株為Bacillus cereus。

2.6 β-淀粉酶基因的克隆與表達(dá)

利用所設(shè)計(jì)引物，以篩選所得菌株D4為模板進(jìn)行克隆，凝膠電泳結(jié)果（圖5）顯示，所得β-淀

粉酶基因條帶大小約為1 700 bp左右。重組質(zhì)粒單酶切結(jié)果（圖6）和雙酶切結(jié)果（圖7）都證明該基因已經(jīng)克隆到質(zhì)粒pET-28a中，測(cè)序結(jié)果顯示該β-淀粉酶基因（包含信號(hào)肽序列）全長(zhǎng)1 641 bp。與NCBI比對(duì)結(jié)果顯示，基因同源率為99%，所編碼的蛋白同源率為100%，可以確定該基因即為β-淀粉酶基因。通過SignalP-4.1對(duì)得到的β-淀粉酶序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該β-淀粉酶可能含有一個(gè)大約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽序列。在PDB數(shù)據(jù)庫中與已知的Bacillus cereus的β-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)：β-淀粉酶的催化功能結(jié)構(gòu)域是一個(gè)高度保守的（β/α）8圓桶結(jié)構(gòu)，酶的催化活性中心位于圓桶口［13］。該基因已經(jīng)提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，編號(hào)為：KJ801918。

圖2 HPLC檢測(cè)結(jié)果

圖 3 菌株鏡檢結(jié)果

表1 生理生化鑒定結(jié)果

SDS-PAGE分析結(jié)果（圖8）顯示，E.coli BL21（pET-BA）與對(duì)照菌株相比，在50-60 kD之間確有蛋白質(zhì)的積累，由于在目的蛋白分子量附近有兩條帶明顯增加，因此對(duì)粗酶液進(jìn)行純化。在本研究構(gòu)建的β-淀粉酶的N端含有一個(gè)由6個(gè)組氨酸組成的標(biāo)簽，我們利用組氨酸的咪唑基團(tuán)與鎳離子有高度親和作用的原理，對(duì)β-淀粉酶進(jìn)行純化。純化后酶液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖9所示。利用凝膠成像儀分析后，圖8和圖9比對(duì)結(jié)果顯示，圖8中50 kD到60 kD之間的兩條帶中的上方條帶與圖9中純化結(jié)果比較接近，兩條帶的大小都為56 kD，與已公

布的蠟狀芽孢桿菌β-淀粉酶分子大小相似。分析出現(xiàn)的兩條帶大小相差在3 kD左右，查閱文獻(xiàn)后認(rèn)為可能是由于所克隆的蠟狀芽孢桿菌β-淀粉酶基因在大腸桿菌中表達(dá)、翻譯、合成的過程中被大腸桿菌自身的蛋白酶類局部降解，使該β-淀粉酶丟失了信號(hào)肽序列，導(dǎo)致一部分蛋白分子量變小。夏巧玉等［19］在對(duì)大豆耐熱β-淀粉酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)研究中，也出現(xiàn)了表達(dá)的蛋白分子量變小的現(xiàn)象。

圖4 基于D4和相關(guān)菌株的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 β-淀粉酶基因的擴(kuò)增

圖6 重組質(zhì)粒的單酶切

圖7 重組質(zhì)粒雙酶切

發(fā)酵E.coli BL21（pET-BA）所得粗酶液與2%淀粉溶液反應(yīng)24 h之后，經(jīng)HPLC分析結(jié)果如圖10所示。E.coli BL21（pET-BA）粗酶液利用淀粉產(chǎn)生

麥芽糖的濃度為15.39 g/L。定義β-淀粉酶酶活力單位U：1 min利用2%的淀粉產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。通過反應(yīng)計(jì)算出β-淀粉酶粗酶液酶活力為1 425 U，相對(duì)原始菌株而言，酶活力提高了53.9%。

圖9 純化后蛋白電泳分析結(jié)果

圖 10 HPLC分析結(jié)果

3 討論

β-淀粉酶在與底物相互作用時(shí)，會(huì)發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)（walden inversion），使α-型麥芽糖轉(zhuǎn)變?yōu)棣?型麥芽糖［1］。β-淀粉酶能夠降解直鏈淀粉成麥芽糖，并且在食品行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。展現(xiàn)明等［18］研究發(fā)現(xiàn)，β-淀粉酶的添加量對(duì)麥芽糖產(chǎn)率有較大影響，β-淀粉酶可與普魯蘭酶共同使用來生產(chǎn)結(jié)晶葡萄糖和55%-65%的高麥芽糖漿。從淀粉廠附近土壤中篩選到的菌株，經(jīng)HPLC分析顯示，在相同條件下，其中的A2、D4、E7這3株菌產(chǎn)生麥芽糖較多，濃度分別為9.74、9.98和9.36 g/L。

對(duì)產(chǎn)麥芽糖較多的菌株D4進(jìn)行生理生化以及分子生物學(xué)鑒定。一般認(rèn)為16S rDNA相似性大于99%的菌株可以判斷為同一個(gè)種。通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株與Bacillus cereus 的序列相似性為99%，并且在菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和生理生化特性都與Bacillus cereus一致，確定其為Bacillus cereus。Takashi等［14］從Bacillus cereus中克隆得到了β-淀粉酶基因，并分析認(rèn)為完整的β-淀粉酶基因包括一個(gè)30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和一個(gè)與生淀粉結(jié)合的區(qū)域，認(rèn)為該淀粉酶具有消化生淀粉的能力。

克隆的菌株D4的β-淀粉酶基因序列Balst結(jié)果顯示，與已公布的Bacillus cereus的β-淀粉酶基因的同源性為99%，氨基酸序列同源性為100%，并且該β-淀粉酶也同樣包含一個(gè)大約由30個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。Reinikainen［15］將淀粉酶基因克隆到含有噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒中，發(fā)現(xiàn)有17%的酶蛋白可以分泌到細(xì)胞外。Nakajima指出，能夠分泌到細(xì)胞外的淀粉酶蛋白分子中一些氨基酸可能與膜的通透性有關(guān)。王為先等［16］克隆的芽孢桿菌的β-淀粉酶基因未經(jīng)過改建即可以將表達(dá)產(chǎn)物全部分泌到大腸桿菌細(xì)胞外。而本試驗(yàn)克隆的D4菌株β-淀粉酶基因也包含一段信號(hào)肽序列，Bacillus cereus與芽孢桿菌同為桿菌屬，但并沒有在細(xì)胞外檢測(cè)到β-淀粉酶酶活。可能兩種菌的信號(hào)肽序列具有較大的差異。

就目前研究發(fā)現(xiàn)，在各種生物體中均發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切型的α-淀粉酶，然而只在植物和少數(shù)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了β-淀粉酶［17］。夏巧玉等［19］成功地將大豆耐熱β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并得到表達(dá)產(chǎn)物。楊華等［20］利用α凝集素系統(tǒng)首次將大麥β-淀粉酶成功展示在釀酒酵母表面，為全細(xì)胞催化劑研究與應(yīng)用打下了一定基礎(chǔ)。將真核細(xì)胞β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)具有一定難度，但就微生物產(chǎn)β-淀粉酶而言，目前已報(bào)道的微生物β-淀粉酶大多為中溫型，最適反應(yīng)溫度為40-60℃。鄒艷玲等［2］從土壤中篩選到一株高產(chǎn)β-淀粉酶的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其最適作用溫度為65℃。蒙健宗等［21］認(rèn)為在構(gòu)建基因工程菌方面，常用的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和溫控誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均存在限制其實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的缺點(diǎn)。改用由滲透壓?jiǎn)?dòng)子Pro U控制的T7 RNA聚合酶（RNAP）合成的大腸桿菌宿主菌，并成功地表達(dá)了熱硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes的耐高溫β-淀粉酶基因，以NaCl作為誘導(dǎo)劑，濃

度為0.6 mol/L，酶反應(yīng)溫度達(dá)到70℃。利用微生物生產(chǎn)β-淀粉酶相比于植物更具有優(yōu)勢(shì)，微生物生產(chǎn)過程不受季節(jié)、原料等影響，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)，所產(chǎn)β-淀粉酶性能穩(wěn)定、均一，這些都是以植物為原料進(jìn)行β-淀粉酶生產(chǎn)所難以達(dá)到的［22］。從Bacillus cereus中克隆的β-淀粉酶基因所構(gòu)建的重組菌株E.coli BL21（pET-BA）能夠通過發(fā)酵法快速得到大量高活性的β-淀粉酶。

4 結(jié)論

本研究從土壤中篩選到一株具有β-淀粉酶活性的細(xì)菌D4，經(jīng)過生理生化以及分子生物學(xué)鑒定，確定為Bacillus cereus。將其β-淀粉酶基因克隆，在大腸桿菌中得到表達(dá)。重組菌E.coli BL21（pET-BA）產(chǎn)淀粉酶酶活力相對(duì)于原始菌株提高了53.9%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Isolation of Beta-amylase-producing Bacteria and Cloning，Expression of Beta-amylase Gene in Escherichia coli

Li Meng Chen Lifei Yang Jianlou Ma Chunling
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，School of Food & Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250000）

A bacterium which can degrade starch was isolate from the soil near the starch factory, was identified as Bacillus cereus by means of morphology and physiological-chemical characterization as well as 16S rDNA sequencing. Beta-amylase gene was cloned from the strain by PCR, and gene sequence was analyzed, which can encode a signal peptide which contains about 30 amino acids. The beta-amylase gene was cloned and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The results showed that recombinant bacteria can produce beta-amylase, and enzymatic activity increased by 53.9% compared with the parent.

Beta-amylase Bacillus cereus Isolate clone Expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.027

2014-05-22

山東省中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金項(xiàng)目（C010302）

李猛，男，碩士，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：limeng3530@163.com

馬春玲，女，副教授，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：machunling20022@163.com