VPA聯(lián)合As2 O3對(duì)NB4細(xì)胞VEGF、NF-κB和MMP-9表達(dá)的影響

王陶然，張志華，王麗紅，趙 蕾，朱松巖，郝長來*

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液病科，河北承德067000;2.承德市中醫(yī)院超聲科，河北承德067000)

急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性白血病的一種。As2O3是治療APL有效、安全的藥物。As2O3應(yīng)用早期可以誘導(dǎo)白細(xì)胞數(shù)急劇增長，導(dǎo)致白血病細(xì)胞的浸潤，增加了患者治療的危險(xiǎn)性。有報(bào)道小劑量的As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)增 高［1－2］，VEGF能刺激腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)，VEGF 及 MMP 的表達(dá)受NF-κB的調(diào)控，共同作用促進(jìn)腫瘤的生長和浸潤。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)可通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，從而抑制白血病細(xì)胞浸潤、遷移［3］。本研究以NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察VPA聯(lián)合As2O3對(duì)VEGF、NF-κB 及MMP-9表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

NB4細(xì)胞系由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所王建祥教授惠贈(zèng)。VPA(Sigma公司)，用滅菌注射用水稀釋為20 g/L和1 g/L的溶液，－20℃冰箱密閉避光保存，臨用前用不含血清和抗生素的RPMI 1640液稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NB4細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，同時(shí)加入青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 U/mL)，37 ℃、5%CO2，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將NB4細(xì)胞懸液調(diào)整為1×105個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶，每瓶10 mL，實(shí)驗(yàn)組分別加入1.0 mmol/L VPA、1.0μmol/L As2O3和1.0 mmol/L VPA+1.0μmol/L As2O3，對(duì)照組不加藥。

1.4 MTI法檢測藥物抑制效應(yīng)

NB4細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中;加入不同濃度的藥物，并設(shè)3個(gè)復(fù)孔;37℃、5%CO2分別培養(yǎng) 24、48和 72 h后，加入 MTT溶液10μL/孔;繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入三聯(lián)液(10%SDS+5%異丁醇 +0.012 mol/L HCl)100μL/孔，于37℃放置過夜后，酶標(biāo)儀檢測各孔540 nm處吸光度值，另設(shè)空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組和藥物實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。存活率(%)=實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照組A值×100%。

1.5 基因表達(dá)的檢測

按Trizol試劑盒說明書操作方法提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm處測A值，A260/A280在1.8～2.0，根據(jù) A260值計(jì)算 RNA濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，分別用 VEGF、NF-κB、MMP-9 和β-actin的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參照(285 bp、621 bp)。VEGF上游引物:5'-GAAGTG GTGAAGTTCATGGATGTC-3'，下游引物:5'-CGAT CGTTCTGTATCAGTCTTTCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為409 bp。NF-κB 上游 引物:5'-CCGCTTAGGAGGGAGAGCC-3'，下游引物:5'-TATGGGCCATCTGTTGGCAGTG-3'，擴(kuò)增片段為193 bp。MMP-9上游引物:5'-GGAGA CCTGAGAACCAATCTC-3'，下游引物:5'-TCCAATA GGTGATGTTGTCGT-3'，擴(kuò)增片段為 296 bp。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 5min、變性95℃ 45 s、退火58℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，38個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 8 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L溴化乙啶)，80 V電泳30～50min，凝膠成像系統(tǒng)照相，用圖像分析系統(tǒng)檢測其吸光度(A)值，與內(nèi)參β-actin的A值的比值來顯示結(jié)果。

1.6 蛋白表達(dá)的檢測

用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)(50 mmol/L)Tris-HCl pH 8.0、1%NP-40、150mmol/L NaCl、0.5%去氧膽酸鈉、0.1%SDS)，用細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒按說明提取各組細(xì)胞細(xì)胞核蛋白質(zhì)，以BCA蛋白定量測定法檢測蛋白濃度，每一樣品取30μg，按比例(4∶1)加入5×上樣緩沖液，至水浴箱中變性10 min。蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗稀釋液中4℃孵育過夜，洗膜3次后，二抗稀釋液中室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑反應(yīng)1 min，用X線片曝光，對(duì)底片上的顯影條帶進(jìn)行計(jì)算機(jī)吸光度掃描定量。以β-actin條帶作為總蛋白內(nèi)對(duì)照，以Lamin B條帶作為核蛋白內(nèi)對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，多組間采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組對(duì)NB4細(xì)胞系存活率的影響

單用As2O3組細(xì)胞存活率比對(duì)照組降低;As2O3聯(lián)合VPA組較單用As2O3組細(xì)胞存活率下降(P＜0.05)(圖1)。

2.2 NB4細(xì)胞VEGF、NF-κB 和MMP-9的表達(dá)

As2O3組 VEGF、NF-κB 和 MMP-9 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。單用VPA組無差異。而 As2O3+VPA 組 VEGF、NF-κB和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)低于單用As2O3組(P ＜0.05)(圖2，表1)。

圖1 VPA聯(lián)合As2 O3對(duì)NB4細(xì)胞存活率的影響Fig 1 VPA and As2O3 treatment group on the influence of the cell survival rate±s，n=3)

圖2 NB4細(xì)胞VEGF、NF-κB和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig 2 VEGFm RNA and protein expressions of NB4 cell line

表1 NB4細(xì)胞VEGF、MMP-9及NF-κB的表達(dá)Table 1 VEGF，MMP-9 and NF-κB expressions in NB4 cell±s，n=9)

表1 NB4細(xì)胞VEGF、MMP-9及NF-κB的表達(dá)Table 1 VEGF，MMP-9 and NF-κB expressions in NB4 cell±s，n=9)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with As2 O3．

058 065 As2O3 0.426±0.012* 0.340±0.007* 0.832±0.049* 0.520±0.030* 1.250±0.043* 0.648±0.078*VPA+As2O3 0.129±0.007# 0.152±0.003# 0.236±0.023# 0.124±0.006# 0.223±0.011# 0.328±0.019#

3 討論

As2O3是治療APL安全、有效的藥物。但在臨床上As2O3存在早期誘導(dǎo)分化階段白細(xì)胞數(shù)急劇增長，白血病細(xì)胞的浸潤增加了病人治療的危險(xiǎn)性。研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞浸潤現(xiàn)象與 VEGF有關(guān)，VEGF能夠刺激MMP-9的合成和分泌，而核因子-κB(NF-κB)的活化在該途徑中起著關(guān)鍵性的作用［4］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示As2O3作用于NB4細(xì)胞48 h后VEGF、NF-κB、MMP-9表達(dá)較對(duì)照組增加。根據(jù)這一結(jié)果推測小劑量As2O3在治療血液腫瘤的同時(shí)還伴有一定程度的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲的作用，可能機(jī)制為NF-κB的活化促進(jìn)VEGF及MMP-9的表達(dá)，共同作用促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤的生長和浸潤［5－6］。如何減輕As2O3的不良反應(yīng)而不影響其療效，是臨床工作者和科研人員面臨的一個(gè)重要問題。聯(lián)合用藥，多靶點(diǎn)治療是腫瘤防治的新策略。

VPA的抗腫瘤治療已經(jīng)成為其應(yīng)用的新領(lǐng)域，它能夠抑制腫瘤血管生成［7］，使腫瘤細(xì)胞因缺血、缺氧而部分死亡，從而延緩腫瘤生長和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。這種抑制作用是通過VEGF介導(dǎo)的信號(hào)系統(tǒng)完成的。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)加用VPA后VEGF、NF-κB及MMP-9的表達(dá)均較單用As2O3時(shí)明顯降低。VPA通過影響NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，抑制NF-κB依賴的啟動(dòng)子活性，抑制VEGF的生成，降低MMP的表達(dá)，從而延緩腫瘤生長和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［8］。

通過本研究證實(shí)，VPA聯(lián)合小劑量As2O3可使NB4細(xì)胞存活率降低并降低單獨(dú)應(yīng)用As2O3導(dǎo)致的NB4細(xì)胞VEGF、NF-κB及MMP-9表達(dá)增高。說明VPA能夠降低As2O3的不良反應(yīng)，這對(duì)臨床提高應(yīng)用As2O3治療APL患者的療效，探討聯(lián)合治療具有重大意義。

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