哺乳動物細胞線粒體基因組的轉錄及調控機制研究進展

熊 偉，張海洋，楊紅娟，杜亞曼

（大理學院基礎醫學院，云南大理 671000）

線粒體是在各類真核細胞中廣泛存在的由雙層膜包被的細胞器，直徑在0.5～10 μm左右。真核細胞各自擁有的線粒體在大小、數量及外觀等方面上都有所不同。線粒體擁有自身的遺傳物質和遺傳體系，是一種重要的半自主性細胞器，在生物能量轉換和新陳代謝中處于中心地位，所以被稱為“細胞的動力工廠”。細胞行使各種生命活動所必需的能量，大約95%來源于線粒體氧化磷酸化過程產生的ATP。此外，線粒體也涉及細胞的其他重要功能，比如脂肪酸的代謝、細胞的程序性死亡、活性氧自由基的產生、三羧酸循環以及鈣離子的轉運等。存在于真核細胞線粒體內的核外線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA），稱為線粒體基因組，線粒體的功能受核基因組和線粒體基因組的雙重控制。研究表明，哺乳動物線粒體DNA以類核的形式存在于線粒體基質中，其拷貝數可以是一個或者多個，有獨立自主的DNA復制、轉錄和蛋白質合成系統〔1〕。其中哺乳動物線粒體基因組的轉錄與調控機制研究一直是醫學研究和生命科學研究的熱點問題，本文歸納和總結了近年來線粒體轉錄調控相關因子的研究進展。

1 哺乳動物線粒體基因組的結構

哺乳動物細胞mtDNA多為雙鏈、閉合環狀DNA分子。人mtDNA全長有16596 bp，根據兩條鏈的G+T含量不同和變性氯化銫密度梯度離心分為重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）。見圖1。線粒體基因組共編碼了2個rRNA，22個tRNA和13個氧化呼吸鏈蛋白亞基。其中，重鏈編碼的基因有2個rRNA（12s rRNA和16s rRNA），14個tRNA，2個ATP酶的亞基（ATPase 6和ATPase 8），3個細胞色素氧化酶亞基（COX I，COX II，COX III），細胞色素b亞基（cytb）和6個NADH脫氫酶亞基（ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5），輕鏈編碼的基因有8個tRNA和1種蛋白（ND6）。哺乳動物的mtDNA基因排列都十分緊密，基因之間沒有間隔，沒有內含子，tRNAPhe基因和tRNAPro基因之間一段長約1.1 kb的片段是僅有的非編碼區，稱為D-loop區，包括了H鏈復制起始位點（OH），L鏈轉錄啟動子（LSP）和mtDNA轉錄所需的一些順式作用元件，如中央保守區序列（Central conserved sequence blocks domain，CSB），終止相關序列（Termination-associat?ed sequence，TAS），TFAM結合位點等〔2〕。

注：OrH和OrL表示重鏈和輕鏈復制起點，HSP和LSP表示重鏈和輕鏈轉錄啟動子（箭頭表示方向），粗線區表示rRNA和編碼蛋白的基因，圓圈表示tRNA基因。方框表示MTERF結合位點。

2 哺乳動物線粒體基因組的轉錄單元與調控機制

哺乳動物mtDNA上一共有3個轉錄起始位點，即2個H鏈轉錄起始位點（HSP1，HSP2）和1個L鏈轉錄起始位點（LSP）。HSP1位于tRNAPhe基因上游16 bp處，轉錄終止于16S rRNA基因的3′末端，編碼大量rRNA。HSP2位于12S rRNA基因5′末端附近，轉錄產生一條幾乎覆蓋整條H鏈的多順反子mRNA。位于D-loop區域的LSP，轉錄產生一條完整的L鏈多順反子RNA〔3〕。見圖2。

圖2 哺乳動物線粒體基因組轉錄調控模式圖

哺乳動物mtDNA轉錄過程需要很多蛋白質和轉錄因子的共同參與，目前研究初步確認了哺乳動物細胞中組成mtDNA轉錄裝置的成員，主要包括線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，mtTFA or TFAM）、轉錄因子B（mitochondrial tran?scription factor B，mtTFB or TFBM）、線粒體RNA聚合酶（mitochondrial RNA polymerase，mtRPOL or POLRMT）以及線粒體轉錄終止因子（mitochondrial transcription termination factors，MTERFs）等多種重要的轉錄因子。

2.1 線粒體RNA聚合酶（POLRMT or mtRPOL）線粒體RNA聚合酶屬于類T7 RNA聚合酶家族，是線粒體中僅有的一種由核基因組編碼的RNA聚合酶〔4〕。線粒體RNA聚合酶最早在酵母細胞中發現（稱為Rpo41），后來才在人類細胞中發現。酵母線粒體RNA聚合酶的大亞基和噬菌體的單體RNA聚合酶同源，而小亞基和細菌RNA聚合酶中決定轉錄起始的因子有關，因此真核細胞線粒體RNA聚合酶可以看作是介于最簡單的噬菌體RNA聚合酶和具有中等復雜程度的細菌RNA聚合酶之間的復合體〔5〕。人類POLMT基因定位于19p13.3，cDNA全長3831 bp，其編碼的蛋白質由1230個氨基酸殘基構成，N端的41個氨基酸殘基為該蛋白定位線粒體的前導肽，C端則包含一系列的保守結構域。進入線粒體后，成熟的POLRMT由1189個氨基酸殘基構成。POLRMT在細胞線粒體內不能進行特異的基因轉錄，需要在TFAM、TFB1M或TFB2M等轉錄因子的存在才能啟動線粒體DNA的轉錄〔6〕。Maniura-Weber等在體外重建線粒體DNA轉錄體系的實驗也證實了這一點〔7〕。

2.2 線粒體轉錄因子A（TFAM or mtTFA） 線粒體轉錄因子A是最先發現的線粒體轉錄起始調節因子，其在mtDNA的復制、轉錄、mtDNA類核結構的形成和mtDNA修復等方面都發揮著很重要的作用。TFAM以二聚體形式結合到線粒體基因組HSP和LSP特異序列上，通過線粒體RNA聚合酶的作用，在體內和體外都能調節mtDNA重鏈基因和輕鏈基因的轉錄。對哺乳動物TFAM基因結構的研究發現，該基因定位于10q21，共有7個外顯子和6個內含子。其中，根據序列長度的不同，這6個內含子被分為2組，I、III和VI號內含子小于600 bp，而另外3個內含子則均大于1.8 kb。人類的TFAM是一個25 kDa大小的蛋白質分子，屬于以彎曲、纏繞、伸展和結合為特征的高遷移蛋白家族（HMG box蛋白家族）的成員之一。它包含兩個由27個氨基酸殘基連接的HMG結構域和一個由25個氨基酸殘基組成的C末端尾巴〔8〕。其中，C末端尾巴是TFAM特異性識別和結合DNA的結構，對于線粒體DNA的特異性轉錄有非常重要的作用。Larsson等發現敲除TFAM基因的小鼠由于mtDNA損耗會導致胚胎致命性損傷，說明TFAM對于維持mtDNA的完整性和細胞的生存是必須的〔9〕。最初的研究認為，TFAM是一個小的堿性蛋白，能夠與HSP和LSP上游-12～-39 bp處的識別位點結合〔10〕。但隨著研究的深入發現，在哺乳動物細胞中，mtDNA幾乎是被TFAM包繞起來的，TFAM對于mtDNA來說是過量的〔11〕。Dairaghi等的體外轉錄實驗顯示，當體系中的hTFAM終濃度達到0.7 nM時開始出現LSP特異性轉錄產物，并在hTFAM終濃度達到70 nM時轉錄效率最高，超過這一濃度逐漸下降，當hTFAM終濃度達到7000 nM時，由LSP起始的轉錄幾乎完全被抑制〔12〕，可能是由于與TFAM結合得越多，mtDNA越難以接近其它的轉錄因子，導致降低轉錄的速度。細胞中TFAM的表達水平可能是依據不同細胞特定的代謝情況來調節mtDNA的包裝和轉錄活性，低濃度的hTFAM對線粒體H鏈和L鏈的轉錄有明顯的激活作用，但存在一個飽和值，hTFAM濃度過高反而會導致H鏈和L鏈的轉錄水平下降或完全被抑制，但在一般情況H鏈和L鏈TFAM的轉錄水平是接近的〔13〕。在體外研究中發現，TFAM表達水平的高低直接影響TFB1M/POLRMT以及TFB2M/POLRM的轉錄起始活性，二者之間存在著劑量效應關系〔11〕。由核編碼的TFAM調節mtDNA的復制和轉錄的精細機制尚未完全證實。另外，也有報道認為TFAM還參與了哺乳動物mtDNA的復制和損傷修復過程〔14〕。

2.3 線粒體轉錄因子B（TFBM or mtTFB） 線粒體轉錄因子B（TFBM）是在哺乳動物線粒體裂解物中發現的一種與RNA甲基轉移酶同源的蛋白因子，它與釀酒酵母中的單體轉錄因子sc-TFB同源〔15〕。人類TFBM有兩個亞型，分別命名為TFB1M和TFB2M，編碼它們的基因分別定位于6q25.1和1q44。通常，TFB1M的轉錄活性是TFB2M的1/10，研究發現，除了甲基轉移酶的活性，TFB1M主要在線粒體中核糖體的生成和蛋白翻譯的調節中發揮作用。人類線粒體TFB1M可以使核糖體12S rRNA小亞基保守莖環的一系列腺嘌呤甲基化；深入研究發現，TFB1M是一種具有雙重功能的蛋白質，既有轉錄因子的活性，也有rRNA甲基轉移酶的活性〔15〕。TFB2M可能在物種進化的過程中丟失了甲基轉移酶的功能而成為一個更加高效的轉錄因子。Adán等在黑腹果蠅Schneider細胞中采用RNAi的方法下調了TFB2M的水平，導致線粒體中RNA轉錄本的豐度下降了2～8倍〔16〕。然而，用同樣的技術沉默TFB1M基因后線粒體中RNA轉錄本沒有明顯變化，卻導致線粒體中蛋白質的表達水平顯著下降，這一現象提示TFB1M可能在翻譯調節過程中發揮重要的作用，TFB2M則是真核生物中重要的轉錄調控因子〔17〕。

體外模擬人mtDNA轉錄體系的研究發現，TFB2M的轉錄活化效率要比TFB1M至少高兩個數量級。TFB1M或TFB2M與POLRMT可以直接形成一種異源二聚體，隨著TFB2M的增加，轉錄速率加快，而且還發現這兩個TFBM轉錄因子都能夠通過TFAM羧基末端尾巴發生蛋白質-蛋白質相互作用。當mtTFB2M與mtRNA pol的比例達到1:1時，轉錄速率達到最大〔18〕。

線粒體DNA轉錄的起始很可能是這樣一個過程：TFAM特異性的結合到HSP和LSP上游的識別位點，由于TFBM也能與TFAM的C-末端親和接觸，從而把TFBM-mtRPOL帶到轉錄起始位點，通過蛋白-蛋白相互作用形成轉錄啟動復合體來提高轉錄起始的效率〔19〕。

2.4 線粒體轉錄終止因子（MTERFs） 真核細胞線粒體轉錄終止因子是一類由核基因組編碼轉運到細胞線粒體，且能夠與mtDNA特異結合的單體蛋白，它們的分子量大小為40 kDa左右，在線粒體復制、轉錄和翻譯中發揮調控作用〔20〕。到目前為止已經鑒定出的動物線粒體轉錄終止因子有3種：果蠅的DmTTF、海膽的mtDBP、人類的MTERF，它們都能夠與POLRMT結合，但與mtDNA結合的位點因不同物種而異〔20-21〕。人MTERF1基因定位于7q21，包含有兩個外顯子，其編碼的蛋白產物分子量為39 kDa。MTERF1在線粒體轉錄中起終止作用，其終止位點在16S rRNA和leucyl-tRNA基因聯結處。線粒體的轉錄終止因子MTERF1能結合雙向終止位點，促進線粒體基因轉錄的終止。線粒體肌病腦病伴乳酸中毒及中風樣發作綜合癥（MELAS）的A3243G點突變導致能解除16S rRNA轉錄終止，并且能減低MTERF1蛋白與線粒體DNA的親和力。研究結果提示，MTERF1蛋白與人類線粒體疾病的產生存在著密切的聯系。進一步的研究發現在人類中還存在一些與MTERF1序列高度同源的蛋白（MTERF2-F4），它們在線粒體基因表達調控中發揮著不同的作用，所以將它們歸納為人線粒體轉錄終止因子蛋白家族〔20-22〕。利用PSI-BLAST的方法與美國NCBI數據庫中蛋白質序列比對顯示，MTERF蛋白家族成員普遍存在于植物與后生動物中，但在真菌中尚未發現與其同源的蛋白質〔22〕。動物實驗研究表明，在小鼠中敲除MTERF2后線粒體mRNA水平下降，氧化磷酸化水平也出現下降。因此推測MTERF2蛋白可能在mtDNA轉錄中起正調控作用〔23〕。2007年Park等在Cell雜志上首次報道了哺乳動物細胞內存在的一個負性調控mtDNA轉錄的因子——核基因組編碼的MTERF3蛋白，此蛋白為哺乳動物胚胎發育所必需，敲除MTERF3蛋白的動物細胞內mtDNA重鏈和輕鏈的轉錄起始活性都顯著增加。通過體內染色質免疫共沉淀技術（Chro?matin immunoprecipitation，ChIP）研究顯示，MTERF3通過與mtDNA啟動子區結合來行使轉錄抑制作用〔24〕?？梢灶A見的是，對MTERF蛋白家族各成員的深入研究將為人們進一步闡明和理解mtDNA轉錄調控的分子機制奠定基礎。

3 問題和展望

隨著近些年來人們對于哺乳動物mtDNA轉錄及調控機制研究的不斷深入，迄今已經初步明確了哺乳動物細胞中組成mtDNA基本轉錄裝置的元件，主要包括TFAM、TFB1M、TFB2M和POLRMT，以及MTERFs等多種調控蛋白，但對mtDNA在機體不同生理條件和病理條件下轉錄和翻譯的分子調控機制（如線粒體基因與核基因的相互作用，組織特異性的調節機制、調控水平和程度等）以及線粒體內核糖體生物發生過程等細節內容并不十分清楚，有待于進一步的研究探索。因此，人們仍在努力尋找著新的線粒體基因表達調控蛋白。對哺乳動物細胞mtDNA轉錄過程及調控機制的進一步研究，不僅有助于深入闡明和理解線粒體基因組的表達調控機制，而且也助于揭示臨床線粒體病（如Laber遺傳性視神經病、Kearns－Sayre綜合征、MELAS、阿爾茨海默病、帕金森癥、線粒體糖尿病和母系遺傳性耳聾等）的發病機制，并為尋找新的線粒體基因治療的靶標奠定基礎〔25〕。

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