m icroRNA對人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的影響

曹 娟 白淑瑋

西安市第四醫院眼科，陜西西安710004

m icroRNA對人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的影響

曹 娟 白淑瑋

西安市第四醫院眼科，陜西西安710004

目的通過對人視網膜母細胞瘤（RB）腫瘤干細胞（CSCs）多藥耐藥性的研究，探討microRNA對腫瘤干細胞多藥耐藥性的影響。方法通過流式細胞儀分選Y79細胞中的ABCG2（+）與ABCG2（-）細胞，作為ABCG2（+）組與ABCG2（-）組；采用MTT比色實驗比較ABCG2（+）組與ABCG2（-）組對抗腫瘤藥物長春新堿、依托泊苷和卡鉑的敏感性，得到候選microRNA。從標本庫中選擇RB組織切片，行LNA-原位雜交，并根據耐藥性分為高耐藥性組與低耐藥性組，通過Real time PCR觀察候選microRNA在兩組中表達差異。結果①分選陽性率：ABCG2（+）分選后（91.7%）顯著高于分選前（5.7%），差異有統計學意義（P＜0.05）。②兩組耐藥性比較：從各個濃度水平上比較，ABCG2（+）細胞的耐藥性明顯高于ABCG2（-）細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。③分選細胞的凋亡率和細胞內藥物蓄積比較：ABCG2（+）組的凋亡率明顯低于ABCG2（-）組，差異有統計學意義（P＜0.05）；ABCG2（+）組的藥物蓄積明顯低于ABCG2（-）組，差異有統計學意義（P＜0.05）。④候選microRNA在不同耐藥性RB切片中的表達：高耐藥組的microRNA表達率（39.3%）明顯高于低耐藥組的microRNA表達率低（5.2%），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論ABCG2（+）是Y79細胞系中的耐藥細胞群，microRNA與腫瘤干細胞的侵襲性和耐藥性密切相關，調控microRNA可以抑制腫瘤干細胞的耐藥性，提高其對化療的敏感性。

microRNA；視網膜母細胞；腫瘤干細胞；多藥耐藥；ABCG2（+）/ABCG2（-）

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）是兒童最常見的原發性眼內惡性腫瘤。調查顯示5歲以下兒童RB發病率高達11.8/100萬，占同齡兒童惡性腫瘤的6.1%[1]。在我國臺灣，RB的5年生存率為81%，其中雙眼RB 5年生存率僅64.3%[2]。流行病學研究中發現，我國RB診斷滯后，化學減容治療效果不佳，很多患者最終不得不接受眼球摘除術來控制腫瘤的發展，這主要是由于部分RB表達多種耐藥相關蛋白如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），多藥耐藥相關蛋白（multi-drug related protein，MRP）、肺耐藥蛋白（lung resistance associated protein，LRP）等，因而對化療不敏感[3]。惡性腫瘤對化療的多藥耐藥性是大多數惡性腫瘤化療效果不佳最主要的原因。現在越來越多的證據表明，microRNA不但廣泛參與各種腫瘤的發生發展與復發轉移，而且與腫瘤耐藥性的產生有關。這些研究都指出：microRNA與腫瘤干細胞的侵襲性和耐藥性密切相關，調控microRNA可以抑制腫瘤干細胞的耐藥性，提高其對化療的敏感性[4-6]。為探究MicroRNA調控人RB腫瘤干細胞多藥耐藥性的機制，本研究組做了相關研究，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Y79細胞（由西安交通大學醫學院眼科實驗室提供），含10%胎牛血清1640培養基、無血清化學限定培養基、10%FBS：1640培養基、抗-ABCG2抗體、IgG2a抗體、山羊抗鼠FITC二抗、MTT試劑盒、Signosis northern blot試劑盒、熒光素酶測試試劑Ⅱ。

實驗用抗腫瘤藥物為長春新堿、依托泊苷和卡鉑。長春新堿濃度梯度為0.1、1.0、10μg/mL，依托泊苷濃度梯度為0、50、100μmol/L，卡鉑濃度梯度為0、50、150μmol/L。長春新堿、依托泊苷和卡鉑的血漿峰濃度（PPC）分別為5.0、2.0、1.0μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 Y79細胞的分選及培養（流式細胞術）

用含10%胎牛血清1640培養基培養，擴增Y79細胞至8×107個，打碎后重懸至濃度1×107個/m L，無菌條件下與抗-ABCG2抗體于4℃孵育20 min，采用IgG2a抗體作為同型對照。PBS洗滌細胞，加入5μL山羊抗鼠FITC二抗，4℃，20 min，3～5次洗滌后上流式細胞儀進行分選。分選后實驗組ABCG2（+）細胞用無血清化學限定培養基培養，對照組ABCG2（-）細胞用10% FBS：1640培養基培養，2～3 d換液1次，定期傳代。流式細胞法，檢測分選后的ABCG2細胞表達率。

1.2.2 化療藥物敏感度實驗（rea l-t ime PCR檢測、MTT比色、引物序列及免疫熒光）

首先委托ABI公設計合成具有莖環（stem loop）結構的反轉錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針。用Trizol抽提總RNA，將抽提的RNA進行反轉錄的cDNAz作為real-time PCR檢測的模板，加入引物及探針（表1），調整好總體積后加入96孔板，設3個重復板。將分選出的ABCG2（+）與ABCG2（-）細胞稀釋至1×105個/m L，接種于96孔板中，每孔105個細胞。加入不同濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑，每種藥物分三個濃度梯度（長春新堿濃度梯度為0.1、1.0、10μg/mL，依托泊苷濃度梯度為0、50、100μmol/L，卡鉑濃度梯度為0、50、150μmol/L）。每種藥物分設7個復孔，設置對照組和空白組（以營養液代替試劑），培養2 d。向每孔分別加入20μLMTT，繼續培養12 h，將各個孔中的營養液全部吸出，溶解，振蕩30min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值（OD值）。

表1 引物序列、長度及用途

1.2.3 檢測細胞凋亡及細胞內藥物蓄積實驗（流式細胞術）

1.2.3.1 細胞凋亡實驗將分選的ABCG2（+）與ABCG2（-）細胞稀釋至1×105個/mL，放入培養箱中進行48 h的培養，然后實驗組加入卡鉑（濃度為1.0μmol/L）；對照組則不加卡鉑。培養24 h后，收集待測細胞，并用3000 r/min離心6min，棄上清液，乙醇固定18h后離心，PBS洗滌細胞，加入5μL山羊抗鼠FITC二抗，4℃，20 min，3～5次洗滌后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3.2 細胞內藥物蓄積實驗將分選的ABCG2（+）與ABCG2（-）細胞稀釋至1×105個/mL，放入培養箱中進行培養24 h，然后加濃度為為1.0μmol/L的卡鉑試劑，接著在培養的第4小時和第24小時后，轉移至新鮮培養基中繼續培養2 h，收集待用細胞于3000 r/min離心機，離心5min，棄上清液，乙醇固定24 h，PBS洗滌細胞3次，4℃，20 min，3～5次洗滌后上流式細胞儀，在448 nm的激光、679 nm的激光下，測定兩組細胞加藥后4、24 h內殘留的卡鉑試劑所釋放的熒光強度。

1.2.4 觀察候選mi c r oRNA在不同耐藥性RB切片中的表達（行病理切片、LNA-原位雜交及rea lt imePCR實驗）

病理科切片，行LRP、MRP1，P-gp免疫組化染色，收集高表達三種蛋白的RB標本6例作為高耐藥組，均低表達的RB標本6例作為低耐藥組；行LNA-原位雜交觀察候選microRNA在高耐藥組和低耐藥組的定位并半定量檢測；蠟塊組織提取RNA，通過realtimePCR觀察候選microRNA在兩組中表達差異。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 19.0進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間計量資料采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分選陽性率

流式細胞儀分選Y79細胞中ABCG2（+）及ABCG2（-），分選后ABCG2（+）為91.7%，顯著高于分選前（5.7%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測ABCG2在Y79細胞分選前后的表達率

圖2 ABCG2（+）/ABCG2（-）細胞對藥物敏感性

2.2 分選細胞對藥物敏感性

MTT法檢測ABCG2（+）及ABCG2（-）細胞對長春新堿、依托泊苷和卡鉑的耐藥性。長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到0.1μg/mL時，可殺滅和抑制ABCG2（-）細胞；長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到1.0μg/mL時，ABCG2（+）表現出顯著抗藥，說明ABCG2（+）細胞在PPC 1.0μg/mL長春新堿、依托泊苷和卡鉑的作用下，依然不受其抑制生長；長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到10.0μg/mL水平以上，對ABCG2（+）細胞才出現抑制作用。對比各個濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑對ABCG2細胞的作用顯示，ABCG2（+）細胞有顯著高于ABCG2（-）細胞的耐藥性，差異有統計學意義（P＜0.05）。在3種化療藥物中，卡鉑抑制細胞生長的作用最為顯著，尤其對ABCG2（-）細胞的抑制最為明顯。見圖2。

2.3 流式細胞儀檢測分選細胞的凋亡率和細胞內藥物蓄積（經PPC 1.0μg/m L卡鉑處理）

應用流式細胞儀，對ABCG2（+）和ABCG2（-）細胞在0、24、48 h凋亡率的檢測結果顯示：ABCG2（-）細胞的凋亡率顯著大于ABCG2（+）細胞，且凋亡率與用藥時間有關。ABCG2（-）出現“亞G1峰”，且隨時間發展而累積，說明有越來越多的細胞凋亡和壞死；ABCG2（+）未出現“亞G1峰”，說明ABCG2（+）細胞未出現明顯凋亡和壞死。ABCG2（+）明顯低于ABCG2（-），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 血漿峰濃度1.0μg/m L的卡鉑對ABCG2（+）/ABCG2（-）細胞凋亡率的影響

應用流式細胞儀，對ABCG2（+）及ABCG2（-）細胞4、24 h時卡鉑熒光強度進行監測（反映卡鉑在細胞內蓄積水平）。峰值及熒光強度表現為：ABCG2（-）細胞峰值右移、平均熒光強度為9.78和15.35，表明細胞內卡鉑蓄積量增加；ABCG2（+）細胞峰值左移、平均熒光強度為4.39和2.17，表明細胞內卡鉑蓄積量減少。ABCG2（+）的藥物蓄積明顯低于ABCG2（-），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.4 候選m icroRNA在不同耐藥性RB切片中的表達

通過對RB病理切片中的高耐藥組的與低耐藥組的rt-PCR觀察，發現高耐藥組的microRNA表達率（39.3%）明顯高于低耐藥組的microRNA表達率低（5.2%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖4 流式細胞儀檢測ABCG 2（+）/ABCG 2（-）細胞卡鉑的細胞內蓄積情況

表2 候選microRNA在不同耐藥性RB切片中的表達情況（%）

3 討論

視網膜母細胞瘤（RB）是兒童最常見的原發性眼內惡性腫瘤。臨床多表現為瞳孔區反射黃白色光，患兒視力減退，甚至造成斜視。腫瘤組織可通過視網膜進入玻璃體，甚至經淋巴結及血液循環轉移至全身，導致患兒死亡。由于RB的化學減容治療效果不佳，多數患者只能通過眼球摘除術控制腫瘤細胞的增生，造成患兒終身眼疾，嚴重影響了患者的身心健康。有關研究顯示，RB化療效果不佳主要是由于其表達多種耐藥相關的蛋白，包括P-糖蛋白P-gpMRP、LRP等[7]。為提高化療對RB的治療效果，學者開始研究視網膜母細胞多藥耐藥性的機制。研究發現，惡性腫瘤對化療的耐藥性根據耐藥譜可分為原藥耐藥和多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR），其中MDR是由一種藥物誘發，但同時又對其他多種結構和作用機制迥異的抗癌藥物產生交叉耐藥，是大多數惡性腫瘤化療效果不佳最主要的原因[8-9]。腫瘤干細胞（CSCs），具有自我更新和多向分化能力。腫瘤干細胞耐藥這一特征，被認為是腫瘤復發、轉移、多藥耐藥的根源[10]。MicroRNA即小RNA，通過結合靶標mRNA抑制蛋白表達，從而構成了一種新的蛋白表達調控機制。由于microRNA與腫瘤干細胞的侵襲性和耐藥性密切相關，因此調控microRNA可以抑制腫瘤干細胞的耐藥性，提高其對化療的敏感性。為探究MicroRNA調控人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的機制，本研究組通過ABCG2分選RB細胞系Y79中的腫瘤干細胞，結合臨床組織標本篩選RB耐藥相關microRNA并進一步研究其功能，探索RB腫瘤干細胞調控多藥耐藥性的分子機制。

本研究結果顯示：①分選陽性率：分選前陽性率僅為5.7%，說明ABCG2（+）細胞只是Y79細胞中的含量極少的亞群，通過流式細胞儀分選后陽性率提升至91.7%，有效提高了ABCG2（+）純度，為下一步實驗提供了高純度細胞。②分選細胞對長春新堿、依托泊苷和卡鉑的藥物敏感性：長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到0.1μg/mL時，可殺滅和抑制ABCG2（-）細胞；長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到1.0μg/m L時，ABCG2（+）表現出顯著抗藥，說明ABCG2（+）細胞在PPC 1.0μg/mL長春新堿、依托泊苷和卡鉑的作用下，依然不受其抑制；長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到10.0μg/mL水平以上，對ABCG2（+）細胞才出現抑制作用。對比各個濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑對ABCG2細胞的作用顯示，ABCG2（+）細胞有顯著高于ABCG2（-）細胞的耐藥性，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明ABCG2（+）細胞對多種化療藥物均有耐藥性，即對化療藥物具有多藥耐藥性。有關研究指出ABCG2可促進細胞排出化學藥，是當今最常用的耐藥標記蛋白之一[11]。有學者利用ABCG2為標志物從RB細胞系和Y79細胞系中分選出了腫瘤干細胞（CSCs），并且發現這種CSCs的自我更新和體內腫瘤形成能力受Wnt/β-catenin通路調節，且對組織的耐藥性有一定影響[12-14]。③流式細胞儀檢測分選細胞的凋亡率和細胞內藥物蓄積（經PPC 1.0μg/mL卡鉑處理）應用流式細胞儀，對ABCG2（+）和ABCG2（-）細胞在0、24、48 h凋亡率的檢測：ABCG2（-）細胞的凋亡率顯著大于ABCG2（+）細胞，且凋亡率與用藥時間有關。ABCG2（-）組出現“亞G1峰”，且隨時間發展而累積，說明有越來越多的細胞凋亡和壞死；ABCG2（+）組未出現“亞G1峰”，說明ABCG2（+）細胞未出現明顯凋亡和壞死。兩組凋亡率比較，ABCG2（+）組明顯低于ABCG2（-）組，差異有統計學意義（P＜0.05）；應用流式細胞儀，對ABCG2（+）及ABCG2（-）細胞4、24 h時卡鉑熒光強度進行監測（反映卡鉑在細胞內蓄積水平）。峰值及熒光強度表現為：ABCG2（-）細胞峰值右移、平均熒光強度為9.78和15.35，表明細胞內卡鉑蓄積量增加；ABCG2（+）細胞峰值左移、平均熒光強度為4.39和2.17，表明細胞內卡鉑蓄積量減少。ABCG2（+）組的藥物蓄積明顯低于ABCG2（-）組，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步說明ABCG2（+）細胞的抗藥性強勁且對化療藥物的蓄積量極低，這一特性提高了ABCG2（+）細胞對藥物的耐藥性。④候選microRNA在不同耐藥性RB切片中的表達：通過對RB病理切片中的高耐藥組與低耐藥組的rt-PCR觀察，發現高耐藥組的microRNA表達率（39.3%）明顯高于低耐藥組的microRNA表達率低（5.2%），差異有統計學意義（P＜0.05）。有學者指出在視網膜前體細胞中RB基因，P53基因，microRNA-17～92同時表達下降時可以抑制RB的形成，從而抑制耐藥性[15]。由此可以看出microRNA在調節腫瘤干細胞多藥耐藥性中起到了重要作用。

綜上所述，microRNA是調控人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的重要因素，可通過調控microRNA來抑制腫瘤干細胞的耐藥性，提高對化療的敏感性，有利于視網膜母細胞瘤患者的治愈。

[1]Kivela T.The epidemiological challenge of the most frequent eye cancer：retinoblastoma，an issue of birth and death[J].British Journal of Ophthalmology，2012，93（9）：1129-1131.

[2]Chang CY，Chiou TJ，Hwang B，etal.Retinoblastoma in Taiwan：survival rate and prognostic factors[J].Japanese Journal of Ophthalmology，2013，50（3）：242-249.

[3]BaiS，Ren R，LiB，etal.Delay in thediagnosisof retinoblastoma in China[J].Acta Ophthalmologica，2011，89（1）：e72-e74.

[4]LiB，Gao R，Zhang H，etal.Studiesonmultidrug resistance associated protein in retinoblastoma[J].Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2011，45（4）：314-317.

[5]GündüzK，Günalp I，YalcndagN，etal.Causesofchemoreduction failure in retinoblastoma and analysis of associated factors leading to eventual treatment with external beam radiotherapy and enucleation[J].Ophthalmology，2014，111（10）：1917-1924.

[6]鐘秀風，李永平，葛堅，等.人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞的分離培養[J].中國病理生理雜志，2012，22（6）：1177-1181.

[7]Yuan J，Chen L，Chen X，etal.Identification ofserummicroRNA-21 as a biomarker for chemosensitivity and prognosis in human osteosarcoma[J].Journal of International Medical Research，2012，40（6）：2090-2097.

[8]Meng F，Glaser SS，Francis H，et al.Functional analysis of microRNAs in human hepatocellular cancer stem cells[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine，2012，16（1）：160-173.

[9]Jeon HM，Sohn YW，Oh SY，et al.ID4 Imparts chemoresistance and cancer stemness to glioma cells by derepressingmiR-9*-mediatedsuppressionofSOX2[J].Cancer Research，2011，71（9）：3410-3421.

[10]鄧永文，方加勝，李茗初，等.膠質瘤中腫瘤干細胞的分離，培養及鑒定[J].中國現代醫學雜志，2005，15（16）：2449-2452.

[11]Zhu Y，Yu F，Jiao Y，et al.Reduced miR-128 in breast tumor-initiating cells induces chemotherapeutic resistance via Bmi-1 and ABCC5[J].ClinicalCancerResearch，2011，17（22）：7105-7115.

[12]Xiang Y，Ma N，Wang D，etal.MiR-152 andmiR-185 cocontributetoovariancancercellscisplatinsensitivityby targetingDNMT1 directly：anovelepigenetic therapy independent of decitabine[J].Oncogene，2014，33（3）：378-386.

[13]Mitra M，Kandalam M，Harilal A，etal.EpCAM is a putative stem marker in retinoblastoma and an effective target for T-cell-mediated immunotherapy[J].Mol Vis，2012，18：290-308.

[14]Bhatnagar N，LiX，Padi SK，etal.Down regulation ofmiR-205 and miR-31 confers resistance to chemotherapy-induced apoptosis in prostate cancer cells[J].Cell Death& Disease，2010，1（12）：e105.

[15]Misawa A，Katayama R，Koike S，et al.AP-1-Dependent miR-21 expression contributes to chemoresistance in cancer stem cell-like SP cells[J].Oncology Research Featuring Preclinicaland Clinical Cancer Therapeutics，2010，19（1）：23-33.

Influence of m icroRNA on multi-drug resistance of cancer stem cell in human retinoblastoma

CAO Juan BAIShuwei
Department of Ophthalmology,the Fourth Hospital of Xi'an City,Shaanxi Province,Xi'an 710004,China

Objective To discuss the influence of MicroRNA on multi-drug resistance of cancer stem cell through human retinoblastoma(RB)cancer stem cells(CSCs)multi-drug resistance research.M ethods ABCG2(+)and ABCG2 (-)cells from Y79 cellswere sorted by flow cytometry,as the ABCG2(+)group and the ABCG2(-)group;the sensitivity of ABCG2(+)and the ABCG2(-)cells for vincristine,etoposide and carboplatin were compared by MTT colorimetric experiment,and then candidatemicroRNA was gotten.RB tissue biopsies were chosen from specimens library,then were given LNA-situ hybridization,and divided into high resistance group and low resistance group according to the resistance,microRNA expression differences in the two groups were observed by real-time PCR.Resu lts①Separating positive rate of ABCG2(+)after separation(91.7%)was significantly higher than that before the separation(5.7%),the difference was statistically significant(P＜0.05).②Resistance comparison,ABCG2 resistance of ABCG2(+)cells was obviously higher than that of ABCG2(-)cells on various levels,the difference was statistically significant(P＜0.05).③The sorting cell apoptosis rate and intracellular drug accumulation comparison,apoptosis rate of ABCG2(+)group was obviously lower than the ABCG2(-)group,the differencewas statistically significant(P＜0.05);the drug accumulation of ABCG2(+)group was significantly lower than the ABCG2(-)group,the difference was statistically significant (P＜0.05).④the expression of candidate microRNA in different resistance RB section,microRNA expression rate of high resistance group(39.3%)was significantly higher than low resistance group(5.2%),the differencewas statistically significant(P＜0.05).Conclusion The ABCG2(+)is the drug-resistant cell line of Y79 cells,microRNA is closely related to the tumor stem cell invasive and resistance,themicroRNA regulating can inhibit the drug resistance of cancer stem cells,improve its sensitivity to chemotherapy.

microRNA;Retinalmother cells;Cancer stem cells;Multi-drug resistant;ABCG2(+)/ABCG2(-)

R739.7

A

1673-7210（2014）09（c）-0004-06

2014-06-16本文編輯：蘇暢）

國家自然科學基金資助項目（編號81302198）。