蛋白質磷酸化對肉品質影響的研究進展

陳立娟，李 欣，張德權，何 凡，陳 麗，沈清武

（中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京100193）

1 蛋白質磷酸化反應的概念

蛋白質磷酸化反應是20世紀50年代Fischer、K rebs等在研究糖原新陳代謝調控時發現的一種動態調控機制。1992年，Fisher和Krebs因其在蛋白質可逆磷酸化方面的研究獲得了諾貝爾生理學及醫學獎。自此，作為最廣泛的蛋白質翻譯后修飾方式，蛋白質磷酸化反應受到了廣泛的關注。蛋白質磷酸化反應是指由蛋白激酶催化的將ATP或GTP上γ位的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基上的過程。該反應主要發生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等殘基側鏈的羥基上，在哺乳動物細胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質發生過磷酸化修飾[3-4]。鑒于蛋白質磷酸化反應在生命活動中的重要意義，研究蛋白質磷酸化反應過程的機理及其對生物功能的影響已成為眾多生物化學家及蛋白質組學家非常重視的問題。用蛋白質組學的理念和分析方法研究蛋白質磷酸化修飾，可以從整體上觀察細胞或組織中磷酸化修飾的狀態及其變化，由此派生出磷酸化蛋白質組學（phosphoproteom ics）這一新概念[5]。磷酸化蛋白質組學從整體水平上研究磷酸化蛋白質在細胞中的組成成分、表達水平、修飾狀態及相互作用規律。在磷酸化蛋白質組學受到關注的同時，各種磷酸化蛋白質的分析技術也應運而生。

2 磷酸化蛋白質的分析技術

對磷酸化蛋白質進行研究，首先要建立磷酸化蛋白質檢測方法，由于磷酸化蛋白質含量非常低，需對磷酸化蛋白質進行富集，同時，蛋白質磷酸化反應是一個動態過程，在很多研究中需對磷酸化蛋白質進行位點分析和定量。鑒于以上需求，磷酸化蛋白質檢測方法的研究主要集中在磷酸化蛋白質的富集、位點分析和定量分析方法上。

2.1 磷酸化蛋白質（肽）的富集

常見的磷酸化蛋白質（肽）的富集方法包括免疫共沉淀法、強陰陽離子交換色譜、MALDI靶板富集法及固定金屬離子親和色譜等。其中免疫共沉淀法主要利用可以特異性識別磷酸化絲氨酸、磷酸化酪氨酸、磷酸化蘇氨酸的抗體與已經發生磷酸化的多肽進行免疫共沉淀，然后利用離心分離的方法純化磷酸化多肽，但是由于磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸的抗原決定簇都比較小，與抗體的結合能力較弱，所以通常只用該方法純化酪氨酸磷酸化多肽[6]。強陰陽離子交換色譜法富集磷酸化肽對樣品的需樣量較大，而且要對分離出的每一種物質進行分析，因而工作量較大。MALDI靶板富集法可實現樣品的直接在線富集和檢測，但是該方法目前只能對相對簡單的蛋白質樣品進行分析，對于復雜生物樣品的富集效果目前仍不理想。固定金屬離子親和色譜法對單磷酸化肽和多磷酸化肽都具有較好的富集能力，與其他方法相比更適合復雜生物樣品中磷酸化肽的富集，但富含酸性氨基酸的非磷酸化肽也能與金屬離子結合造成非特異性吸附，從而對磷酸化肽的富集造成干擾。以上方法各有優勢但仍不能實現對低豐度磷酸化蛋白質（肽）進行大規模高通量的分析，為進一步增強富集效果，減少非特異性吸附，多重富集材料或富集方法的聯用將成為未來磷酸化蛋白質（肽）富集的重要方向[7]。

2.2 生物質譜分析磷酸化位點

利用一級質譜結合串聯質譜可確定磷酸化位點，如通過MALDI-TOF/TOF一級質譜可發現與肽段分子量理論值相差80u（HPO3=80u）的質譜峰，該峰的二級質譜圖中若母離子與旁邊的最高強度的質譜峰相差98u（中性丟失H3PO4=98u），則可確定該肽段為磷酸化肽段，進一步通過二級或多級質譜的譜圖確認具體的磷酸化位點。此外，利用β-消除反應使蘇氨酸、絲氨酸磷酸化殘基轉化為氨乙基丙氨酸（賴氨酸的同形物），此位點可被胰蛋白酶和肽鏈內切酶等酶特異性識別、酶切，通過質譜即可很容易地判斷磷酸化位點。所以磷酸化位點的確認有賴于簡化的串聯質譜和質譜譜圖的應用以及質譜檢測靈敏度的提高[8]。近年來生物質譜技術的發展為蛋白質磷酸化位點的檢測提供了更多可選擇的儀器和方法，如軌道離子阱質譜（Orbitrap MS）、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR MS）等[9]。

2.3 磷酸化蛋白質定量分析

常用的磷酸化蛋白質定量分析方法包括雙向差示凝膠電泳、熒光染料Pro-Q Diamond dye染色和穩定同位素標記法。雙向差示凝膠電泳是在雙向電泳的基礎上發展起來的靈敏且能進行定量分析的新方法，它采用熒光試劑標記蛋白質并通過熒光成像獲取電泳圖像，能夠比較精確地在較寬的動態范圍內對研究者感興趣的蛋白質進行定量，特別對包括有多組別和多個生物學重復情況的研究具有其獨特的優勢。熒光染料染色（Pro-Q Diamond）是Molecular Probes公司前幾年推出的一種磷酸化蛋白質熒光染料，它可以直接對聚丙烯酰胺凝膠中的磷酸化蛋白質進行選擇性染色，無需同位素或特異性抗體，只要通過熒光掃描儀檢測就可以直接顯示出一維或二維凝膠電泳膠上分離的磷酸化蛋白質，對非磷酸化蛋白質的反應性很低，熒光強度會隨著蛋白質磷酸化程度的不同而呈現出一定的變化。2000年，Weckwerth、W illmitzer和Fiehn等首次提出穩定同位素標記（stable-isotope labeling，SIL）與液質聯用進行蛋白質定量，開辟了定量蛋白質組學的一個新技術平臺，與傳統的定量方法（如雙向電泳）相比，穩定同位素標記技術在定量準確度和規模化定量分析方面都有很大的應用前景[10]。

3 蛋白質磷酸化反應與肉品質的關系

由于蛋白質磷酸化反應對生物體內眾多過程都有影響，蛋白質磷酸化反應在越來越多的領域引起關注，目前對于蛋白質磷酸化反應的研究主要集中在醫學、物理化學、生物化學等領域，其中醫學方面的研究主要集中在蛋白質非正常磷酸化與疾病的關系[11-12]以及通過調控激酶水平來達到治療疾病的目的[13]；物理化學方面的研究主要集中在優化磷酸化蛋白質（多肽）的富集方法上[14]；生物化學方面的研究主要集中在蛋白質磷酸化反應對酶活的影響以及蛋白質磷酸化反應與信號傳導的關系[15-16]。

從蛋白質磷酸化反應被發現至今已經有70多年，但此前的研究主要集中在以上提到的醫學、物理化學、生物化學等方面，蛋白質磷酸化反應對肉品質的研究卻較少。蛋白質磷酸化反應在醫學、生物化學等方面的研究使人們意識到蛋白質磷酸化反應對生物體內眾多過程的重要影響，進而引發人們對于宰后肌肉成熟過程中蛋白質磷酸化反應的關注。前期對磷酸化蛋白質研究方法的探索為蛋白質磷酸化反應在肌肉樣品中的研究奠定了方法基礎，而醫學和生物化學方面以肌肉為原料對蛋白質磷酸化反應的研究也為肉品的相關研究提供了理論基礎。近幾年關于蛋白質磷酸化反應對肌肉影響的研究主要集中在宰后胴體蛋白質磷酸化反應與糖酵解、肌肉收縮和蛋白質降解的關系三個方面。

3.1 蛋白質磷酸化反應與糖酵解的關系

糖酵解作為宰后肌肉最主要的供能方式，與肌肉的顏色、pH、系水力以及肌肉僵直都有直接關系。

畜禽養殖環境對畜禽的健康生長具有重要影響。以往養殖場主要以粗放形式來進行，很多畜禽養殖場綜合規劃與布局并不合理，很多飼料喂養在一定程度上缺乏合理性。畜禽養殖棚晝夜溫差大這種問題在一定程度上對畜禽的健康生長將會產生很大影響。

Huang等以豬背最長肌為原料研究蛋白質磷酸化水平與pH下降速率和宰后時間的關系發現，部分蛋白質的磷酸化水平受pH和宰后時間的綜合影響，其中有7種與糖代謝有關的酶磷酸化模式受宰后pH下降速率和宰后時間的綜合影響。他指出不管在體內還是體外大部分糖酵解酶可以被不同的激酶催化發生蛋白質磷酸化反應，之后糖酵解酶的活性或者穩定性會增強。而糖酵解反應是影響宰后pH下降的主要因素，由此Huang等推測蛋白質磷酸化反應通過對糖酵解酶活性的調控進而影響肉的品質[17-18]。

除Huang以外，Doum it[19]、Reiss[20]、Sale等[21]都認為豬背最長肌中的糖酵解酶如丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶的活性受自身磷酸化程度的影響，這兩種酶發生磷酸化反應后會變得更加活躍，因此他們認為蛋白質磷酸化反應可提高肌肉糖酵解反應，他們還認為蛋白質磷酸化反應可通過提高肌肉糖酵解反應、降低宰后蛋白水解反應而對肉色、保水性、嫩度產生不利影響[19]。

蛋白質磷酸化反應與糖酵解反應密不可分，但目前在不同的實驗材料中對于不同種類的酶得出的結論并不一致。Angelo等認為牛背最長肌中部分糖酵解酶的活性與它們的蛋白質磷酸化水平成反比，糖酵解酶如二磷酸果糖酶、烯醇酶發生磷酸化反應后活性會降低[15，22]。

綜上所述，蛋白質磷酸化反應會通過對糖酵解酶活性的調控影響宰后肌肉糖酵解反應，進而影響肉品質。

3.2 蛋白質磷酸化反應與肌肉收縮的關系

很多學者發現包括肌動蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白輕鏈、肌間線蛋白、肌鈣蛋白在內的多種肌原纖維蛋白都會發生磷酸化反應[23-25]。

Gang等通過敲除肌球蛋白輕鏈激酶基因發現肌球蛋白輕鏈發生磷酸化反應會提高平滑肌收縮的速度和強度，由此指出肌球蛋白輕鏈磷酸化是快肌收縮增強的初級生化機制[26]。James等通過改變鈣離子濃度控制肌球蛋白輕鏈激酶活性，發現肌球蛋白輕鏈發生磷酸化會引起肌球蛋白結構改變，并且發現由此會增加肌球蛋白產生收縮力的強度[27]。Joan Gannon通過研究嫩度有顯著差異的3月齡和30月齡小鼠肌肉中蛋白質磷酸化水平的變化和發生變化的蛋白質種類發現，隨著年齡增長蛋白質磷酸化水平發生變化最大的是肌球蛋白輕鏈2、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌間線蛋白。鑒于以上幾種蛋白在肌肉收縮中的重要性，Joan Gannon認為年齡可通過蛋白質磷酸化水平的改變而影響肌肉收縮[28]。Huang等也得出了相似的研究結論，鑒定出的磷酸化蛋白質中很多蛋白質都與肌節功能有關。在磷酸化程度最高的條帶中肌鈣蛋白T，原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈2被鑒定出來。實驗表明宰后肌肉中以上肌原纖維蛋白的磷酸化模式主要受宰后時間影響，其次受pH下降速率影響。鑒于肌原纖維蛋白在肌肉收縮中的重要作用，Huang推測肌原纖維蛋白磷酸化反應可能與肌肉僵直和肌肉品質變化有關[17]。

Perry，Bailey等在研究中發現磷酸化酶b激酶、AMP依賴性蛋白激酶、GMP依賴性蛋白激酶、Ca2+依賴性磷脂敏感蛋白激酶可以使骨骼肌和心肌中肌鈣蛋白I發生磷酸化反應[29-30]，Moir，Pinna等在研究中則發現磷酸化酶b激酶、肌鈣蛋白T激酶、酪蛋白激酶TS、Ca2+依賴性磷脂敏感蛋白激酶可以使肌鈣蛋白T發生磷酸化反應。肌鈣蛋白作為肌肉的主要調節蛋白，直接參與鈣離子控制的肌肉收縮[31-32]。Moir，Perry等在研究中發現肌鈣蛋白發生磷酸化對肌肉收縮的速度和強度有重要影響[29，31]，但是肌鈣蛋白磷酸化對肌肉收縮的影響機制目前并不清楚。

綜合以上學者的觀點可知：包括肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白、原肌球蛋白、肌動蛋白在內的多種肌原纖維蛋白都會發生蛋白質磷酸化反應，但是除肌球蛋白輕鏈以外的肌原纖維蛋白通過蛋白質磷酸化反應對肌肉收縮的具體影響結果以及影響機理有待進一步研究。

3.3 蛋白質磷酸化反應與蛋白質降解的關系

宰后肌纖維蛋白的降解，特別是結構蛋白和細胞骨架蛋白的降解，可導致肌纖維結構完整性被破壞和肉的嫩化，促進肉的成熟[33]。大量研究表明鈣蛋白酶是引起宰后成熟過程中肌纖維蛋白降解和肉嫩化的主要蛋白酶，鈣蛋白酶通過對肌纖維蛋白的降解引起肌肉超微結構的破壞，尤其是Z線的破壞和消失，使得肌原纖維小片化和肉的嫩化[34-35]。

Fabio和Toyo等認為蛋白激酶可以使肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I發生蛋白質磷酸化反應，肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I由AMP依賴性蛋白激酶催化發生蛋白質磷酸化反應后會降低對鈣蛋白酶降解信號的靈敏度，從而可以降低鈣蛋白酶對它們的降解[36-37]。Doum it等指出鈣蛋白酶抑制蛋白會發生蛋白質磷酸化反應，而鈣蛋白酶抑制蛋白發生蛋白質磷酸化反應后會增強對鈣蛋白酶的抑制作用，從而減少鈣蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解[19]。由以上學者的觀點可知，肌鈣蛋白發生磷酸化反應可以降低鈣蛋白酶對它的降解而鈣蛋白酶抑制蛋白發生磷酸化反應可以降低鈣蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解。

Angelo等認為蛋白質磷酸化不僅能調節糖酵解酶的活動，還能增強結構蛋白的穩定性，由此他們推測牛肉中的蛋白質磷酸化反應是由肌肉轉變為可食用肉的重要影響因素，翻譯后修飾可能對肉的嫩度框架復雜性有深遠影響[15]。王思丹等也認為作為細胞骨架的主要組成部分之一的肌動蛋白發生磷酸化可能會改變肌細胞的結構，例如肌纖維結構的降解等，進而影響宰后肌肉的僵直進程[38]。

如前所述，蛋白質磷酸化反應會對肌肉的糖酵解反應產生影響，而糖酵解反應是影響宰后pH下降速率的主要因素，對于肌肉宰后成熟過程而言，pH的變化是引起諸如蛋白酶活性等改變的重要因素[39]，pH通過引起蛋白酶活性的改變影響宰后肌肉中蛋白質的降解，也就是說蛋白質磷酸化會通過多種中間途徑對蛋白質降解產生間接影響。

綜上所述，蛋白質磷酸化反應對肌肉內部的眾多生理生化反應都有重要影響，目前的研究認為蛋白質磷酸化反應會通過對糖酵解酶活性的影響調控宰后肌肉糖酵解反應，通過對肌球蛋白輕鏈的影響促進肌肉收縮，通過對肌鈣蛋白、鈣蛋白酶抑制蛋白、結構蛋白等的影響降低蛋白降解。肌肉收縮和蛋白降解是影響宰后肌肉品質變化的兩個重要因素，對肌肉的尸僵進程和嫩化過程有重要影響。由此我們可以認為，蛋白質磷酸化反應是由肌肉轉變為可食用肉過程中的重要影響因素。

4 展望

近年來，隨著分子生物學、生物化學、生物信息學、計算機等技術的快速發展，作為蛋白質組學的重要組成部分的磷酸化蛋白質組學已經在磷酸化肽及磷酸化蛋白的鑒定、磷酸化位點分析及其定量分析方面取得了很大的成就，然而，在研究中新問題不斷涌現，研究者們面臨著重大的挑戰。由于蛋白質磷酸化是一個動態過程，在細胞中磷酸化蛋白含量低，磷酸化位點可變，磷酸肽的質譜信號常常會受到抑制，目前還沒有一種方法或技術路線可以解決磷酸化蛋白質組學中遇到的所有問題，所以磷酸化蛋白質組學研究需要更加特異有效的分離方法，高靈敏度的鑒定方法以及快速、高效、準確的質譜檢測方法，從而實現從少量生物樣品中解析全部磷酸化蛋白質的目標。

對于蛋白質磷酸化反應與肉品質的關系雖有部分研究已取得結論，但是具體機制仍不明確。并且目前國內針對蛋白質磷酸化與肉品質關系的研究較少，還需要大量的研究工作，當前的主要任務是在先進的磷酸化蛋白質組學技術的基礎上探究蛋白質磷酸化反應影響嫩度、保水性、色澤等品質的機理，以便為改善肉品質提供理論依據。

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