近視遺傳學研究進展

廖 萱，蘭長駿

(川北醫學院附屬醫院眼科，四川 南充 637000)

近視是一種常見的屈光不正，在全世界范圍人群中有很高的發病率。近幾十年來，近視的發病率和嚴重程度均呈快速增加的趨勢，尤其以包括中國在內的東亞國家的青少年兒童表現更為明顯。隨著近視度數增加和眼軸延長，發生眼部病理性改變和合并癥的風險亦明顯增加，甚至可以發生不可逆的視功能喪失的嚴重后果，同時帶來沉重的社會負擔和經濟負擔，成為重要的全球性公共衛生問題[1]。近視的病因和發病機制仍未完全闡明，尋求有效的防治方法一直是眼科和視覺研究的難點和熱點。普遍認為單純性近視是遺傳-環境因素的多向相互作用(基因-基因累積作用/基因-環境交互作用)引起的多基因復雜疾病，遺傳因素對于近視的發生發展極其重要。然而在易感基因的定位和遺傳分析中仍存在很多懸而未決的問題。現代分子生物學和遺傳學技術的革命性進步，提供了一個前所未有的機會來破譯近視的病因和發病機理。隨著研究越來越深入，遺傳標記已從細胞學標記和生化標記發展到能夠直接反映DNA分子水平差異的分子標記，尋找遺傳易感基因突變位點的策略由定位克隆改變為采用全基因組掃描策略，下一代測序技術消除了罕見變異檢測的技術障礙，基因組的研究重心由結構向功能研究轉變，近視的遺傳學研究已經進入一個全新的階段。

1 遺傳標記

遺傳標記(genetic marker)是用來區分不同的個體或種群，能夠穩定遺傳的性狀或物質，是遺傳分析不可缺少的重要工具。從廣義的角度，指反映遺傳多態性且遵循遺傳規律的全部生物特征；從狹義的角度，指反映個體或群體間基因組差異的DNA位點或序列。自19世紀中期Mendel首先將豌豆形態學性狀作為遺傳標記以來，其逐漸得到發展和豐富，形態學、細胞學、生物化學及免疫學標記等被廣泛應用。DNA分子標記(molecular marker)直接反映核酸水平上的遺傳變異，消除了環境影響，遺傳穩定且信息量大，是目前的主要的遺傳標記。DNA分子標記經歷了以下幾個階段的發展。

1.1 限制性片段長度多態性

1974年Grodzicker等[2]首次提出將限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)用作腺病毒溫度敏感突變的遺傳標記，開創了直接應用DNA多態性作為遺傳標記的新階段。1987年人類基因組第一張RFLP標記圖譜發表，RFLP作為第一代DNA分子標記開始被廣泛應用。由于DNA序列上限制性內切酶位點的堿基發生突變或替換，使得原有酶切位點消失或產生新的酶切位點；或限制性酶切位點之間發生了堿基的插入或缺失，使得酶切位點相對位移或DNA內部結構發生重排。因此，用限制性內切酶消化后就會產生長度不同的DNA片段，即RFLP。這些不同大小DNA片段，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)或者Southern blot轉膜雜交后，即可以分出不同的基因型，從而揭示出遺傳位點的多態性。由于RFLP多態性標記的等位基因具有共顯性的特點，易于區分純合型和雜合型，并且結果穩定可靠，因而在近視的易感基因位點篩選中得到廣泛應用，鑒定出一些高度近視候選基因。但由于RFLP檢測較難自動化，在全基因組上的分布密度較低，多態性頻率也較低，使得應用受到一定的限制。

1.2 微衛星多態性

1989年Litt等[3]發現了微衛星多態性(microsatellite polymorphism，MP)在人心肌肌動蛋白基因中的存在，MP作為第二代DNA標記開始被認識。微衛星也稱簡單串聯重復(simple sequence repeats，SSRs)或短串聯重復(short tandem repeats，STRs)，由核心序列和側翼序列組成。核心DNA序列呈串聯重復排列，重復單位一般由2～6個核苷酸構成，重復次數n為幾次到數十次，以(CA)n、(AAAN)n、(AAN)n和(GT)n較為常見；側翼DNA序列位于核心序列的兩端，為保守的特異單拷貝序列，能使微衛星特異地定位于染色體常染色質區的特定部位。微衛星產生的機制被認為是由復制滑脫(replication slippage)或DNA滑動鏈與互補鏈堿基錯配，導致一個或幾個重復單位插入或缺失而產生。MP因不同的重復單位以及不同的重復次數構成多態性，使其在不同人群、不同種族間分布具有差異性。微衛星標記的檢測通常通過分析PCR擴增產物有無特異性帶型，并比較擴增產物的大小的方式，檢測出不同個體在每個微衛星座位上的遺傳結構。雖然MP標記具有分布廣泛、信息豐富、檢測相對簡便而高效等優點，被廣泛地用于高度近視易感位點研究，但是可能出現同源異型或異源同型，以及無效等位基因，也給微衛星DNA標記技術的應用帶來困難。

1.3 單核苷酸多態性

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代DNA分子標記開啟了新的分子標記時代[4]。1998年Wang等[5]首先報道了根據SNP技術建立的人類遺傳圖譜。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸堿基的變異所引起的DNA序列多態性，在人群中這種變異的發生頻率一般大于1%；而小于1%被認為是點突變。通常把人類基因組中最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>5%的SNP稱為常見變異，≤5%為稀有變異或低頻變異。在基因組DNA中的任何堿基均有可能發生變異。在蛋白質編碼區的SNP和位于表達調控序列中的SNP在功能或致病方面具有更重要的意義，常常被稱為功能多態。SNP分布并不均勻，由于選擇壓力等原因，絕大多數SNP位于非編碼區，位于基因組中蛋白質編碼的序列僅約為3%。

SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上[6]。據估計在人類基因組中兩個無親緣關系的個體間平均每1000個核苷酸中就有一個以上的SNP，因此整個人類基因組中存在300萬個以上的SNP，覆蓋全基因組的0.4%[5]。SNP位點并不是獨立遺傳的，而是一組位置比較接近的且幾乎不發生重組的連鎖不平衡SNP位點(即單體域haplotype block)一同遺傳。雖然SNP在任一特定位點上只有兩個等位基因，所涵蓋的信息量有限，但是SNP在基因組中數量巨大且分布頻密，所以整體而言其多態性遠高于RFLP與MP；而且SNP是基于單核苷酸的突變，遺傳穩定性相對較高，具有比MP更準確的優勢[7]。其二態性易于基因分型和等位基因頻率估計，適合復雜疾病的易感基因或致病基因研究。

1.4 拷貝數變異

人類基因組遺傳變異有許多種形式，從顯微鏡可見的染色體到微觀的單核苷酸突變，也有許多DNA片段大小為kb到Mb范圍內亞微觀的拷貝數。2004年Sebat[8]和Iafrate[9]各自所在的研究小組首次在人類基因組中描述了拷貝數變異(copy number variation，CNV)的存在，指出有兩個大片段的CNV可以導致出生缺陷等重大疾病，其多態性也成為一種新的遺傳標記在人類基因組中被廣泛地研究。之后，更多的研究小組發現CNV與疾病有著密切的聯系。CNV是基因組結構變異的一種形式[10]。與SNP類似，CNV除了一部分會致病以外，也可以作為一種遺傳多態性存在于人類及其他物種的基因組上。相對于SNP的概念，將人群中等位基因頻率大于1%的CNV定義為基因組拷貝數多態(copy number polymorphisms,CNP)，90%以上的CNV屬于這一類型，而小于1%的CNV稱為罕見CNV。

人類基因組內大約存在1 500個CNV區域，覆蓋基因組的12%[11]。CNV產生的機制與減數分裂時期的DNA重組、DNA毀壞后的錯誤修復、DNA移動元件的活動等有關。CNV為揭示生物遺傳和變異的分子基礎提供了新的思路。雖然目前發現的人類基因組中SNP的個數遠遠高于CNV，但CNV在整個基因組中覆蓋的核苷酸總數卻大大超過SNP的總數，結合這兩種遺傳標記進行研究，將為認識人類基因組的構成、個體間的遺傳差異、遺傳致病因素提供新的線索，深入理解復雜疾病的分子機制和遺傳基礎提供理論依據。

2 大型國際基因組項目

從50年代的遺傳物質結構模型的提出，到90年代開始的國際人類基因組計劃興起的基因組學革命，科學家們一直致力于解讀人類遺傳的信息，揭開人類奧秘的基礎。隨著大型國際基因組項目的相繼開展與完成，人類基因組研究已經成為生命科學發展的主線，對于包括近視在內的多種疾病遺傳研究起著重要的推動作用。

2.1 國際人類基因組計劃

國際人類基因組計劃(the international human genome project，HGP)[12]于1990年啟動，旨在闡明人類基因組30億核苷酸的序列，發現所有人類基因并闡明其在染色體上的位置，使得人類第一次在分子水平上全面地認識自我。2003年個人完整基因組序列圖譜的繪制，提供了研究基因結構和功能的基礎。直至2006年人類最后一個染色體-l號染色體的基因測序結果公布，HGP經歷16年，圖譜精確度覆蓋了人類基因組的99.99%。同時人們發現，完成的HGP只是一個以測序為主的結構基因組學研究，真正揭示基因組的功能也許是整個21世紀的任務。HGP的內涵及外延在不斷地擴展。

2.2 國際人類基因組單體型圖計劃

國際人類基因組單體型圖計劃(the international HapMap project，HapMap)[13-14]相繼在2002年啟動，構建了人類基因組中常見遺傳變異的等位基因和基因型頻率以及單體型形式，提供了洞察人類基因組差異的窗口和關聯研究的有力工具。HapMap分別在2005年和2007年公布了第Ⅰ和Ⅱ期的數據，分別對4個種群的270個個體樣本，超過100萬SNP和200萬SNP進行基因分型；在2010年公布了第Ⅲ期的數據，增加了6個種群，樣本擴展到1 115個個體，檢測SNP約155萬個，基因分型的精度已達單個核苷酸水平。所有數據免費向公眾開放并發布在共享數據庫(www.hapmap.org)。受前期的測序技術所限，HapMap計劃僅對人類基因組中常見遺傳變異的SNP位點進行基因分型。隨著高通量基因分型和測序技術的發展以及千人基因組計劃的展開，人類遺傳學研究進入了一個新的時代。

2.3 千人基因組計劃

千人基因組計劃(the 1 000 genomes project，1 000 Genomes)[15-16]自2008年啟動，目標在于組裝大量個人的基因組全序列數據，繪制出最為詳盡的人類全基因組遺傳多態性圖譜，提供更精確全面的遺傳變異信息和人類基因組結構變異的公共數據庫(www.1000genomes.org)。通過研究數以千計的個體，建立不同人種中所有常見變異及絕大部分稀有變異的深度目錄，有助于更廣泛地分析與疾病有關的基因變異。第一階段研究進行三項前期實驗，旨在評估研究覆蓋率、方法、平臺和機構，以確定全基因組測序的最好策略。第一項實驗包括對2個核心家庭的基因組進行的全基因組測序；第二項包括對來自4個種群的179個體進行全基因組測序；第三項包括對來自7個種群的697個體進行外顯子測序。前期數據已在2009年發布。第二階段計劃對7個種群的2 500個體的基因組進行4×覆蓋度測序和外顯子靶向測序，目前也取得了階段性成果，2012年公布了包含14個國家和地區1 092人的基因數據的高分辨率人類基因組遺傳變異整合圖譜。從人類基因組計劃耗費10多年才繪出個人的完整基因組圖譜，到千人基因組計劃短短4年間就已獲得超過1 000人的基因組數據，見證了基因組研究的高速發展，在全基因組范圍內篩檢與疾病相關的遺傳變異成為可能。

2.4 DNA元素百科全書

然而HGP發現基因組中僅有1.5%的序列是給蛋白質編碼的，而對其余98.5%的序列知之甚少。為了完成HGP遺留的任務，2003年啟動了又一項大型國際合作項目——DNA元素百科全書(Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE)[17]。ENCODE項目旨在識別出人類基因組序列中的所有功能元件，包括轉錄、轉錄因子聯合、染色質結構和組蛋白修飾區，繪制人類基因組甲基化可變位點的表觀基因組圖譜。對至少147種細胞類型進行了1 648項計算機分析、生物化學試驗以及測序研究，目前已經確認約80%的基因組都具備某種功能，包括7萬多個啟動子區，負責與蛋白質結合控制基因表達；近40萬個增強子區，負責調節遠距離基因的表達。研究者分離了基因組中轉錄的RNA并進行測序，識別出約120種轉錄因子的DNA結合位點，作用相當于控制基因活性的開關；繪制了基因組中被甲基團覆蓋的區域圖，被甲基團覆蓋通常表明這里的基因是沉默的；檢驗了組蛋白的化學修飾方式，這種修飾有助于將DNA包裝成染色體，增強或抑制基因表達區；用DNaseI的酶繪制了125個細胞型中的調節區，這種酶對與組蛋白結合的DNA影響很小，卻會切斷與其他調節蛋白連接的DNA，如轉錄因子。ENCODE歷時十年的工程取得重大進展，將進一步詮釋遺傳變異調控的機制，對生命科學研究領域產生深遠的影響。

3 遺傳學研究方法

染色體不能直接用來測序，因此首先要將基因組分解為較易操作的小的結構區域，這個過程簡稱為作圖(mapping)，是遺傳學研究的主要方法，分為遺傳圖和物理圖，在此基礎上整合并引入基因標志形成轉錄圖或基因圖。利用遺傳作圖進行連鎖分析(linkage analysis)和關聯研究(association study)是尋找近視致病基因的主要策略。

3.1 連鎖分析

連鎖分析通過鑒定經多代傳遞仍完整的單體型為基礎，檢測在一個家系中等位基因和疾病的傳遞是否相關。迄今為止，已識別出人類基因組中近視相關的基因片段三十多個，經國際人類基因命名委員會通過并已在OMIM數據庫(www.ncbi.nlin.nih.gov/omim)編碼的基因位點共有23個(MYP1～MYP23)。這些易感區域分布在絕大多數染色體上，主要為常染色體顯性遺傳，少數是常染色體隱性(MYP18)或性連鎖隱性遺傳(MYP1、MYP13)。部分基因位點多次被后續研究證實，為近視的遺傳異質性研究提供了有力的證據。

另外有一些新鑒定的位點尚未被OMIM收錄。Wojciechowski等[18]在舊時阿米什人(Old Order Amish)和高加索人近視家系中進行全基因組連鎖分析(genome-wide linkage study，GWLS)研究，發現5qter與舊時阿米什人近視相關，12q24和4q21與高加索人近視相關，進一步meta分析顯示4q21-22在已知的MYP9和MYP11位點附近。Abbott[19]采用GWLS和數量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)定位，在迄今最大規模的高度近視家系樣本中，鑒定出兩個新的潛在位點6q13-16.1和5q35.1-35.2，同時也驗證了先前的近視相關位點。然而復雜疾病具有多種因素參與疾病的進程，單個基因的作用效應微弱，遺傳異質或表型異質性，外顯不完全或擬表型，遺傳傳遞機制不確定等特點。雖然連鎖分析對于發現主效基因十分有效，但是對于中效或微效基因的檢出率較差；基于高度近視家系發現的高外顯率位點，難以代表散發近視病例的低外顯性突變；所定位區域往往包含眾多信息，確定具體的易感基因或位點尚需要大量的工作。因此，連鎖分析雖然在單基因遺傳病的基因定位方面取得了較大的成功，但是難以定位表型影響效應較小的遺傳變異，也難以對易感基因和致病變異進行精確定位，從而限制了連鎖研究在尋找近視致病基因中的作用。

3.2 候選基因關聯研究

關聯研究是通過鑒定經數代傳遞后仍保留完好的相鄰近DNA變異之間的DNA片段，檢測在一個群體中等位基因與疾病的相關性是否存在。因此，關聯研究也可視作是在未觀察到的、可能存在的家系中進行的大規模的連鎖分析。關聯研究依據連鎖不平衡的原理，通過遺傳標記在不同群體中的分布差異來揭示其與疾病的質量或數量性狀間的關系，從而發現與疾病相關的遺傳標記。

候選基因關聯研究(candidate gene association study)基于整合信息學策略，包括功能候選策略，即通過病理生理功能信息進行功能分析及或已知功能基因的同源比較；或者位置候選策略，即通過基因圖譜信息進行初步或精細定位；以及利用比較組學信息或挖掘文獻數據進行候選，搜尋致病相關的候選基因進行關聯研究。目前近視遺傳關聯研究的候選基因主要涉及兩大類：鞏膜細胞外基質生長和重塑的相關基因，如蛋白聚糖類(proteoglycans[20])，膠原類(collagens[21])，纖維蛋白類(fibrillarin[22])，細胞黏附遷移相關的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases[23])以及類尿調節素I基因[24]，生長因子及其受體(growth factors and their receptors[25])；以及視網膜視覺信號處理和傳輸的相關基因，如夜盲蛋白NYX基因[26]，血管活性腸肽受體VIPR2[27]，維生素D受體VDR[28]等。這些被鑒定的近視相關候選基因和位點中，很少處于先前已經鑒定的非綜合征近視的連鎖峰值中，在不同的研究中結果并不能被重復驗證。而且這種假設驅動的方法(hypothesis-driven)只針對已知的候選基因，未能從整體角度系統考察基因組所有的遺傳變異，在探尋高度近視致病基因方面難以有重大的發現和突破。

3.3 全基因組關聯研究

全基因組檢測的無偏特性(hypothesis free)加上關聯研究的統計效能的提高，高通量基因分型技術和新興生物統計學方法的迅猛發展，全基因組關聯研究(genome-wide association studies，GWAS)成為目前探索復雜疾病遺傳易感因素最為有效的研究辦法。迄今已有數項GWAS對近視遺傳易感基因SNP位點進行了探索，不僅驗證了既往候選基因關聯研究發現的高度近視候選基因,還鑒定出多個近視相關的新易感區域或位點，極大地更新了對近視遺傳背景的認識[29-35]。后期的GWAS更聯合國際和國內多中心研究，采用數以萬計的大樣本量，協同遺傳統計學和生物信息學等多學科，顯著地提高了統計效能，獲得更多的遺傳信息。

Verhoeven等[34]以分別來自27個歐洲研究隊列和5個亞洲研究隊列的45 758名屈光不正人群為研究對象，利用Illumina和Affymetrix平臺鑒定出與屈光不正相關的24個新位點。通過評價作為活性調控因子標志的H3K27a修飾和HaploReg注釋的乙酰化，發現許多關聯位點包含有這些調控因子，推測調控功能可能也是一個潛在的機制。這些發現更深化了對近視發病機制的認識。Kiefer等[35]在歐洲人群中進行了迄今為止最大的近視GWAS，包含兩階段的研究對象共54094例，鑒定出20個與ECM重塑、視覺循環、眼球生長以及視網膜神經元發育或信號的聯系等與近視發生發展相關的新易感位點/基因。最顯著關聯位點rs12193446位于LAMA2基因的內含子內，風險比(hazard ratio，HR)及可信區間為0.79(0.76，0.81)。研究構建了Cox比例風險回歸模型進行近視初始發病年齡的全基因組生存分析，結果支持視覺誘發信號激發的視網膜到鞏膜的級聯反應導致近視發生發展的模式，提示早期的眼球和神經元發育對于人類近視的發生發展的重要性。GWAS已經產生了海量數據，有待進一步地處理和有效地利用。

3.4 下一代測序

GWAS基于“常見疾病/常見變異”(common disease common variants,CDCV)假說[36]，并未涵蓋人類基因組中稀有遺傳變異和其他結構變異。由于自然進化中選擇壓力的存在，稀有變異往往是新近發生的效力較強的有害變異[37]。不斷涌現的研究結果表明，稀有遺傳變異對某些復雜疾病的發生起著關鍵性的作用，解釋基因-變異-環境因素之間的相互作用關系需要對更多微效基因稀有變異進行研究。目前GWAS所研究的對象主要是SNP，對SNP以外的其它結構變異并不敏感，例如MP及CNV等等，這些變異包含了多個核苷酸，往往可以影響到基因的表達，因此可能涉及相當一部分復雜疾病的遺傳易感性。對于MAF≤5%甚至MAF≤5‰的稀有遺傳變異以及其他結構變異的探索和研究，將隨著下一代測序技術(next generation sequencing，NGS)的發展逐漸深化。

全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)可以鑒定人類基因組序列的所有變異，但目前成本仍然較高；外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)相對成本低，可以系統分析基因組中蛋白編碼區域的主要遺傳變異[38]。通過WES技術，Shi等[39]已經鑒定出近視位點MYP21(1p22.2)并被OMIM數據庫收錄(OMIM 614167)；最近兩項研究分別鑒定出LRPAP1基因的突變[40]，以及SCO2基因終止密碼子突變c.157C>T[41]與高度近視有關。目標區域再測序(targeted resequencing)在已經鑒定的連鎖峰值區域進一步測序分析，也是成本相對較低的有效手段。Mordechai等[42]通過對以色列貝都因人常染色體隱性遺傳的高度近視家族進行全基因組連鎖研究以及目標區域再測序，將高度近視易感位點定位與染色體3q28上1.7Mb的區域。利用新一代測序技術，針對全基因組、外顯子組或GWAS識別的候選易感區域進行高通量測序和關聯分析，繼而在獨立人群中驗證，有望快速準確識別已有變異并有效發現新的低頻和罕見變異。

4 展望

分子生物學技術的進步為近視遺傳學研究提供了新的手段，近視基因組學研究已經取得了重要進展并積累了海量的研究數據，下一代測序技術也將隨著更高通量和更低成本在近視的遺傳學研究中發揮更大作用。而完全揭示近視遺傳機制，并最終實現近視的個體化醫療，仍然面臨許多挑戰。

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