復方魚腥草對鮑曼不動桿菌體外培養生長的影響

蔡燕，韓雪梅，葉紅，廖琪，汪聰亞，許媛1，，黃義山1，

(川北醫學院 1.附屬醫院檢驗科；2.附屬醫院風濕免疫研究所；3.檢驗系，四川 南充 637000)

中國全國細菌耐藥監測(Mohnarin)2011年度報告[1]中顯示鮑曼不動桿菌的耐藥率持續上升，亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別高達56.8%和58.7%；本院[2]2005年至2010年間分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌占79.24%，泛耐藥菌株占17.20%?？梢婖U曼不動桿菌感染給臨床治療帶來很大的困難，目前被認為是危害全世界尤其是重癥監護病房(intensive care unit，ICU)危重患者健康亟待解決的問題[3]。當前迫切需要研發新的抗菌藥物來治療其引起的重癥感染。我國中草藥中不少藥物具有抗菌作用[4-6]。復方魚腥草片含有魚腥草、黃芩、板藍根、連翹和金銀花等，是一種復合中藥制劑，在臨床上主要用于感冒、咳嗽等，療效顯著。故本實驗擬運用微量肉湯法稀釋法和瓊脂稀釋法探討復方魚腥草對鮑曼不動桿菌生長的是否有影響，為臨床上治療鮑曼不動桿菌感染提供潛在新藥。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 溶液配制 培養基：水解酪蛋白培養基即 MH(Mueller-H inton)肉湯，用去離子水稀釋，高壓滅菌備用。藥物：復方魚腥草片(0.41 g/片，海南海力制藥有限公司生產)，去掉藥片表面的糖衣，碾碎后用生理鹽水配制為128 mg/mL備用。

1.1.2 菌株 采用美國得靈公司生產的NC21鑒定藥敏板及配套試劑和Vitek-32進行菌株鑒定和藥敏測定，從本院檢驗科微生物室 2013年11月9日至 2013年 11月19日臨床分離的鮑曼不動桿菌株中篩選出20株菌株(其中含2株敏感菌株和18株對三類及以上藥物耐藥的多重耐藥菌株)。并以鮑曼不動桿菌的標準菌株ATCC19606作為質控菌株。各菌株皆保存于-80 ℃備用。

1.1.3 儀器 Vitek Special DR100 Colorimeter(美國HACH COMPANY)調節菌懸液，采用美國恒溫振蕩水浴培養箱和恒溫細菌培養箱培養細菌。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 復蘇細菌：將凍存的各株鮑曼不動桿菌接種到MH平板上，35 ℃過夜培養。細菌擴增：挑取單菌落至1 mL肉湯中，35 ℃振蕩培養12 h左右(根據既往經驗，此時鮑曼不動桿菌可進入指數生長期)收集細菌。配制菌懸液：用生理鹽水稀釋各株鮑曼不動桿菌，采用Vitek Special DR100 Colorimeter調整各株細菌濃度為0.5麥氏單位(大約1×108cfu/mL)，并用MH肉湯按1∶1000稀釋備用。

1.2.2 藥物稀釋 實驗時各組藥物的終濃度分別為：6 400 μg/mL、3 200 μg/mL、1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL。(1)微量肉湯稀釋法：將128 mg/mL的復方魚腥草素稀釋10倍，各取100 μL加至96孔微量板相應孔中備用。(2)瓊脂稀釋法：將128 mg/mL的復方魚腥草素稀釋1倍為64 mg/mL，再依次倍比稀釋為終濃度的10倍，各取1 000μL加至6 mm培養皿中，然后取9 mL經高壓滅菌的MH瓊脂分別加至相應的平板中，輕微搖勻，待凝固后放4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 細菌培養 (1)微量肉湯稀釋法：各取100 μL已稀釋好的菌懸液接種到96孔微量板的相應孔中，同時設定不加藥物和不加細菌的空白孔(只加MH肉湯)、不加藥物的陽性細菌對照孔和不加細菌的陰性對照孔，每孔總量為200 μL， 不足者以 MH 培養基補入。每一藥物濃度均做3個復孔。加樣完畢后，將96孔板置恒溫(35 ℃)水浴振蕩培養箱中培養。(2)瓊脂稀釋法：將稀釋好的菌液各取2 μL接種至含復方魚腥草的平板，每株細菌、每一藥物濃度各做 3個重復點，同時設定以細菌接種無藥物的 MH平板作為細菌陽性對照和未接種細菌的陰性對照板。將平板置于 35 ℃細菌培養箱中培養。

1.2.4 結果檢測 (1)微量稀釋法：結果判定：培養>18 h后，將肉眼觀察無細菌生長(培養孔中上清清澈，沉淀中僅見藥物沉渣)的培養孔中的藥物濃度作為相應菌株的最低抑菌濃度。(2)瓊脂稀釋法：培養18 h后，肉眼觀察平板上細菌生長情況，記錄各株細菌在不同濃度的藥物平板上的生長情況。以無細菌生長的最低藥物濃度作為該菌對應的MIC值。

2 結果

2.1 微量肉湯稀釋法

培養18 h后觀察：各株鮑曼不動桿菌的陽性對照孔皆有細菌生長，空白對照孔和不加細菌的陰性對照孔均無細菌生長，提示該實驗結果真實可信。每株細菌在含有不同濃度藥物的MH肉湯中生長均受到影響，隨復方魚腥草濃度的增加，細菌生長形成的濁度逐漸降低，所有菌株的最高藥物濃度孔(6 400 μg/mL)中上清清澈，沉淀中僅見藥物沉渣，部分菌株的3 200 μg/mL孔也未見細菌生長，即微量肉湯稀釋法的MIC值為3 200～6 400 μg/mL。標準菌株ATCC19606的MIC值為3 200 μg/mL。

2.2 瓊脂稀釋法檢測

肉眼觀察見未加藥物的陽性板上皆有菌落形成，而未接種細菌的陰性板上無細菌生長。6 400 μg/mL藥物平板上皆無細菌生長。3 200～800 μg/mL的藥物平板上有部分菌株生長，余各濃度的藥物平板上皆有細菌生長。即MIC值為3 200～800 μg/mL。標準菌株ATCC19606的MIC值亦為3 200 μg/mL。

3 討論

多重耐藥菌(包括鮑曼不動桿菌)已經嚴重影響患者的安全和醫院質量管理?！吨袊U曼部分桿菌感染診治與防控專家共識》[7]中指出由于鮑曼不動桿菌具有快速獲得和傳播耐藥性的能力，多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動桿菌已呈世界性流行，不僅是我國最重要的“超級細菌”，更是全球抗感染領域的挑戰。許多國家均采取一定的措施來抗耐藥菌感染[8]。新藥的研發遠遠趕不上細菌耐藥的步伐，而中藥抗感染的歷史悠久，不易產生耐藥性，而且不少中藥還具有逆轉細菌耐藥等優點[9-10]，從現有的中藥中尋找藥物可能為臨床上抗抗鮑曼不動桿菌感染的提供新的思路。

復方魚腥草片含有魚腥草、黃芩、板藍根、連翹和金銀花等，均為中草藥中常見的抗感染治療藥物。劉如玉等[11]采用煮沸法分別對幾味中藥進行提取，發現這幾味中藥對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌等均有不同程度的抑制作用。葉冠龍等[12]采用黃芩、連翹等的水煎劑也能體外抑制鮑曼不動桿菌的生長。復方魚腥草片對急性咽炎、扁桃體炎等療效顯著，可能與其中的藥物具有抗菌作用有關。本研究通過在21株鮑曼不動桿菌(包括標準菌株ATCC19606)中重復 3次后的實驗結果顯示：復方魚腥草片對鮑曼不動桿菌的生長具有抑制作用；選取的20株鮑曼不動桿菌中含2株敏感株，18株多重耐藥株，敏感株和耐藥株的生長皆受到復方魚腥草的影響，耐藥株和敏感株的MIC值間無差別。蘇顯中等[13]分析了鮑曼不桿菌標準菌株ATCC19606的耐藥性和耐藥基因，發現該菌株對鏈霉素、諾氟沙星、氯霉素、紅霉素、四環素和氨芐西林等均有很高的耐藥性，有多種耐藥機制參與其耐藥。復方魚腥草對ATCC19606也有一定的抗菌作用。鮑曼不動桿菌可通過產生抗菌藥物滅活酶、改變藥物作用靶位、減少到作用靶位的藥物量等方式對現有的抗生素產生耐藥性，而本實驗中所有耐藥菌株的生長被復方魚腥草抑制，說明鮑曼不動桿菌的這些耐藥機制對復方魚腥草無影響。提示復方魚腥草可作為抗鮑曼不動桿菌(即使是多重耐藥菌株)感染的潛在藥物。但其具體作用機制及其與現有抗生素之間的協同作用尚待進一步研究。

【參考文獻】

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