熒光素鈉滴眼液微生物限度檢查的驗證

張錦興 李運景 李卓亞

微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目。為確保微生物限度檢查方法的科學性和檢驗結果的準確性，從2005年開始至現行2010年版《中國藥典》規定藥品的微生物限度檢查應進行方法學驗證[1]。熒光素鈉滴眼液是中山市人民醫院配制的供院內使用的常用制劑，由熒光素鈉和碳酸氫鈉組成，臨床用于眼角膜損傷和角膜潰瘍的診斷，為確保檢驗方法的準確性和可靠性及保證患者用藥安全、有效，對該品種微生物限度檢查進行了計數方法及控制菌檢查方法的驗證[2]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CS101-1EB電熱鼓風干燥箱(JS029)，DHP-600電熱恒溫培養箱(JS031)，SHH-250L電熱恒溫培養箱(JS039)。

1.2培養基 營養瓊脂培養基(批號：3101692，廣東環凱微生物科技有限公司)，玫瑰紅納瓊脂(批號：120717，北京陸橋技術有限責任公司)，膽鹽乳糖培養基(批號：3101620，廣東環凱微生物科技有限公司)，pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：201010153，廣東環凱微生物科技有限公司提供)。

1.3菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕、大腸埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)〔CMCC(B) 63 501〕、白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕、黑曲霉菌(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕。以上菌種由杭州微球生物技術有限公司提供為微生物培養基控品。

1.4藥品 熒光素鈉滴眼液(中山市人民醫院生產，批號：20130520,20130721,20130922)。

2 方法與結果

根據《中國藥典》2010版二部附錄XI J 微生物限度檢查法進行驗證試驗。

2.1菌落計數方法的驗證

2.1.1菌液制備 使用前注入1.1 ml稀釋液溶解，混勻使用。

2.1.2供試液制備 取供試品10 ml，加pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，作為1 ∶ 10供試液。

2.1.3驗證方法 ①試驗組：取1 ∶ 10供試液1 ml分別注入10個平皿中，再依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5種菌的菌懸液各1 ml(菌數為50～100cfu/ml)，每株菌平行制備2個平皿，立即傾注營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基，分別置30～ 35℃培養48 h和23～28℃培養72 h。②菌液組：分別取上述稀釋的菌液1 ml注入平皿內，每個菌株平行制備2個平皿，立即傾注營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基，分別置30～35℃培養48 h和23～28℃培養72 h。測定所加的實驗菌數。③供試品對照組：取1 ∶ 10供試液1 ml按試驗組方法(不加試驗菌)，測定供試品的本底菌數。④標準規定：試驗組的回收率應不低于70%[3]。

2.1.4結果 以上試驗結果表明，采用平皿法檢驗熒光素鈉滴眼液，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均大70 %。因此，熒光素鈉滴眼液的細菌、霉菌、酵母菌數的測定可采用平皿法進行，試驗結果見表1。

2.2控制菌檢查方法驗證[4]大腸埃希菌檢查，結果見表2。

2.2.1陽性對照試驗 取1 ∶ 10供試液10 ml和10～100 cfu的大腸埃希菌，同時接種至100 ml膽鹽乳糖培養基中，依據大腸埃希菌檢查法試驗。

2.2.2陰性對照試驗 取1 ∶ 10供試液10 ml和10～100 cfu的金黃色葡萄球菌，同時接種至100 ml膽鹽乳糖培養基中，依據大腸埃希菌檢查法試驗。

2.2.3供試品對照組 取1 ∶ 10供試液10 ml，接種至100 ml膽鹽乳糖培養基中依據大腸埃希菌檢查法試驗。

表1 熒光素鈉滴眼液細菌數、霉菌和酵母菌數計數三次驗證試驗結果

表2 大腸埃希菌檢查驗證結果

注：“+”： 紫外燈光下呈熒光及MUG反應呈陽性； “-”： 紫外燈光下不呈熒光及MUG反應呈陰性

上述方法陽性對照組檢出了大腸埃希菌，陰性對照組未檢出大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，供試品組未檢出大腸埃希菌。說明驗證方法通過。

3 討論

3.1驗證試驗結果表明熒光素鈉滴眼液無抑菌作用，可直接取樣按常規方法進行微生物限度檢查。

3.2微生物限度方法學驗證試驗中所用的標準菌種的傳代次數不得超過5代，并需要定期進行菌種鑒定，以檢查菌種有無變異或污染，保證驗證結果的準確性。

3.3用常規法進行計數驗證時，在加供試品與菌液至平皿時應將其盡可能點散開，即用點注的方法使其均勻地分布于整個平皿，傾入培養基后充分搖勻，這樣不容易出現供試品與菌液分散不均致回收率計數重現性不高的現象[5]。

3.4枯草芽孢桿菌在平皿上生長時容易粘連成片，影響計數，可將50～100 cfu菌液于平皿上充分點散開，倒入瓊脂后充分搖勻后，菌落呈點狀，易于計數[6]。

[1] 國家藥典委員會. 《中國藥典》二部. 中國醫藥科技出版社, 2010, 附錄XIJ.

[2] 高捷. 復方甘草口服溶液微生物限度檢查法驗證實驗. 中國醫藥導報,2008,19(5) : 30-31.

[3] 國家藥典委員會.《中國藥典》. 二部. 中國醫藥科技出版社, 2010，附錄XIJ: 108-109.

[4] 國家藥典委員會.《中國藥典》. 二部. 中國醫藥科技出版社, 2010，附錄XIJ: 111.

[5] 張婷,鄭紹忠,劉全芳.復方呋喃西林滴鼻液微生物限度檢查的驗證.中國藥房，2011, 22(45): 4274-4276.

[6] 張婷, 鄭紹忠, 劉全芳. 鹽酸麻黃堿滴鼻液微生物限度檢查的驗證. 海峽藥學，2011, 23(1): 53-54.