實現HIV功能性治愈的策略和挑戰

康文，汪春付，孫永濤

·導向與述評·

實現HIV功能性治愈的策略和挑戰

康文，汪春付，孫永濤

HIV可潛伏感染形成病毒儲存庫。聯合抗反轉錄病毒治療能有效抑制病毒復制，但無法徹底清除病毒，且患者須終生服藥，由此帶來許多不良反應，并對世界衛生體系帶來巨大的負擔。通過特殊的治療手段可實現即使中斷抗反轉錄病毒治療也能長期維持HIVRNA檢測不到、機體免疫功能正常的治療后控制狀態，即HIV功能性治愈，這是治療HIV感染的下一個可及的目標。研究人員正在探索包括激活病毒儲存庫、早期治療、基因治療和免疫治療在內的多種策略，以期實現HIV功能性治愈。當前研究既取得一定進展也面臨諸多挑戰，未來仍需多種策略的聯合以實現HIV功能性治愈的目標。

獲得性免疫缺陷綜合征；HIV；治療學

曾幾何時，HIV/AIDS是令人談虎色變的世紀頑疾。然而，1996年聯合抗反轉錄病毒治療（combined antiretroviral therapy,cART）的問世，幾乎從根本上改變了HIV/AIDS的疾病進程，極大降低了HIV/AIDS的發病率和病死率，顯著延長了患者壽命，甚至減少了HIV的傳播[1]。可以說cART是HIV/ AIDS治療史上的第一次革命，具有劃時代的意義。盡管cART幾乎可以長期高效地抑制體內對藥物敏感的病毒株，重建機體的免疫功能，但其仍不能使免疫功能完全恢復正常，不能阻止其他非AIDS疾病如非AIDS性腫瘤、心血管疾病和神經認知功能紊亂等的發生[1]。更重要的是，絕大部分ART藥物僅對復制中的病毒有效，而HIV可以前病毒DNA形式整合入受感染的長壽的中央記憶型T細胞的染色體，并使受染細胞進入靜息狀態，從而潛伏下來形成穩定的病毒儲存庫，導致cART無法徹底清除病毒[1-2]。一旦cART中斷，病毒儲存庫中的前病毒再度活躍復制，幾乎所有患者血漿HIV RNA都會反彈至治療前水平[3]，因此cART對患者意味著終生服藥。截至2012年底，全球有35 200 000例HIV感染者[4]，這意味著有如此龐大的人群正在或即將終生接受ART，這無疑對全社會和各國的公共衛生體系是沉重的負擔。因此，我們有必要尋找終生cART以外的其他替代療法，更進一步來講，是開始HIV/AIDS治療的第2次革命—HIV的“治愈”。

近年來，關于HIV“治愈”的報道（“柏林病人”、“密西西比嬰兒”和法國VISCONTI隊列的14例患者在ART中斷后血漿病毒載量仍檢測不到）引起了廣泛關注[5-8]，這說明至少在某些個體內實現HIV“治愈”是可能的，同時也鼓舞了研究人員對治愈HIV感染的信心。那么，什么才是HIV“治愈”？對大多數感染性疾病而言，治愈意味著徹底根除體內的病原體，然而對HIV來說，治愈可分為“根治（eradication）”和“功能性治愈（functional cure）”。根治意味著通過治療清除了體內包括病毒儲存庫在內的全部病毒，當cART中斷后HIV感染也不會復發。而功能性治愈是一種治療后病情持續緩解的狀態，即通過有限的治療長期、最大限度地抑制HIV復制，雖不能完全清除病毒儲存庫，但是可將其有效減少到可控的程度，同時重建機體的免疫功能，使其足以控制殘留的潛伏的病毒儲存庫，表現為患者即使中斷cART后雖仍可檢測到HIV DNA，但不出現血漿HIV RNA反彈，且機體免疫功能長期維持正常。實現HIV的根治尚為時過早，因為現有cART方案甚至是強化ART方案均不能徹底清除分布在外周血、腸道淋巴結、肝、脾、骨髓及中樞神經系統等組織器官中的潛伏病毒，以及潛伏在靜息CD4+T細胞、骨髓干細胞、巨噬細胞和星狀細胞等中仍具有復制能力的病毒[1,9-11]。曾經一度認為惟一1例實現根治的是Timothy Brown（即“柏林病人”），該患者因急性髓性白血病接受了造血干細胞移植，而造血干細胞供體恰恰攜帶對HIV具有天然抵抗力的突變的CCR5純合子基因（CCR5△32/△32），患者中斷ART后體內HIV RNA一直保持陰性[6-8]。但近期報道表明該患者直腸活體組織檢查樣本中又可檢測到極低水平的HIV DNA[8]，說明其仍是功能性治愈。因此，實現功能性治愈是近期內可及的目標，這不僅可限制病毒復發，也可降低HIV傳播的幾率。

另一例功能性治愈的“密西西比嬰兒”雖然在停藥后第27個月出現血漿HIV RNA反彈，但這并不意味著HIV功能性治愈的前途黯淡無光，這恰恰說明實現HIV功能性治愈依然面臨嚴峻的挑戰，任重而道遠，而且這些病例依然向科學家提供了許多關于控制HIV儲存庫的至關重要的線索，并啟示了實現功能性治愈的諸多策略。目前國際上已啟動了15項以上的關于HIV功能性治愈方面的臨床研究項目[12]。這些研究大體上可以分為以下幾類：“kick and kill”策略、早期治療策略、CCR5Δ32基因敲除策略和免疫治療策略。

1 “趕盡殺絕”（kick and kill）策略

該策略包括兩步：首先使用刺激基因表達的藥物來激活靜息CD4+T細胞，使其中潛伏的HIV活化并合成HIVRNA。隨后，一旦這些細胞被活化，理論上它將轉變為短命的效應性細胞并最終死亡，只要ART仍足以抑制新產生的HIV RNA，就有望耗竭這些HIV儲存庫。如果儲存庫被耗竭或足夠小，且機體的免疫系統足以控制HIV，即可實現功能性治愈。

關于如何活化病毒儲存庫，目前值得關注的是組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors,HDACi）。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）通過組蛋白的去乙酰化，使DNA更緊地纏繞在組蛋白上，導致這些DNA不易被轉錄，從而維持HIV的潛伏狀態。HDACi可以打開染色質，使潛伏的HIV前病毒更易于被轉錄。一些已用于抗腫瘤治療的HDACi正嘗試來激活HIV病毒儲存庫，其中包括伏立諾他（vorinostat,SAHA或VOR）、帕比司他（panobinostat,PNB）和羅米地辛（romidepsin,RMD）等[13-15]。現已證實單劑SAHA可使靜息CD4+T細胞中的HIVRNA轉錄增強4.8倍[13]。一項5例加用SAHA的臨床試驗（每周連用3 d，停4 d，共給藥8周）在用藥初期出現細胞相關的HIV RNA升高，然而在后期這種激活效應卻明顯減弱，這可能與當前SAHA給藥方案導致了藥物不應期的產生有關[16]。然而也有對SAHA激活HIV潛伏感染的臨床價值的爭議存在。有研究發現SAHA的臨床劑量僅能激活0.079%靜息CD4+T細胞中的HIV前病毒，尚不能達到充分激活HIV儲存庫的目的[17]。而且SAHA僅能增強前病毒的轉錄，而不能增強RNA的翻譯和病毒蛋白的表達，這阻礙了完整新病毒的產生和細胞病變的形成，不利于清除激活的感染細胞[2]。這也提示我們須發現更強有效的藥物或聯合其他方法以更有效地激活病毒儲存庫。

PNB體外顯示出10倍于SAHA的激活效果[14]。丹麥的CLEAR試驗（NCT01680094）對15例長期接受cART的HIV感染者聯合12劑PNB（20mg，3次/周，隔周1次給藥，共8周）以觀察其安全性以及對病毒儲存庫的激活能力，結果顯示在首次服藥后，有60%的受試者可在外周血中檢測到低水平的HIV RNA，僅有1例始終未檢測到HIV RNA[18]。在PNB治療期間細胞相關的未剪接HIV RNA（cell-associated unspliced HIV RNA，CA-US RNA）較基線顯著升高，最高升幅的中位值達3.5倍，在治療結束后4周CA-USRNA仍維持升高的狀態[19]。另一項候選藥物RMD的離體試驗顯示其較SAHA和PNB有更強的激活潛伏HIV RNA的作用，激活作用更持久，且與持續抑制的HDAC活性相關[15]。因此RMD可能比SAHA具有更好的臨床應用價值，一項評價HIV-1感染者在cART基礎上聯合單劑RMD對HIV儲存庫激活效果的臨床試驗（NCT01933594）正在進行中。Ⅱ類HDAC（HDAC4）抑制劑也初步顯示出較佳的激活整合的外源基因的效果，且具有更低的細胞毒性[20]，其體內效果有待評估。

除了HDACi，研究人員也在嘗試其他激活病毒儲存庫的方法。白細胞介素（interleukin,IL）-2、抗-T細胞CD3單抗和IL-7等曾先后用于激活T細胞的研究，但因其不良反應嚴重及不能降低HIV病毒儲存庫，不具有臨床應用價值。β-連接素抑制劑C-82能促進HIV感染的長壽記憶型T干細胞分化為短壽效應性CD4+T細胞，能降低這部分所占比例較小但難以被激活的HIV儲存庫[21]，但其實際效果須體內試驗進一步評估。

第二步是清除被激活的感染細胞。最初認為機體的免疫系統可自發識別并進行清除，但有研究表明接受ART的個體CD8+T細胞不能有效清除SAHA激活的HIV感染CD4+T細胞，這些CD8+T細胞在Gag持續刺激后才可清除HIV感染的CD4+T細胞[22]。這表明通過ART重建的機體免疫系統尚不能有效清除被激活的細胞，須通過聯合增強機體HIV特異性免疫應答或免疫毒素的方法來增強對HIV儲存庫的清除效果[23]。例如，有研究使用能結合HIV-1 Env的免疫毒素3B3-PE38（結合了細胞毒素PE38的廣譜中和抗體3B3）來靶向性識別并殺傷被活化的HIV感染的細胞，小鼠體內實驗表明聯合3B3-PE38較單獨ART可降低組織中HIV RNA達3.2 log10[24]。另一項RMD聯合治療性疫苗Vacc-4x的臨床試驗（NCT020921-16）也在進行中。該項目嘗試先通過RMD激活潛伏感染的HIV，再通過治療性疫苗Vacc-4x增強機體對病毒的免疫應答，以識別并清除活化的細胞。

總之，“趕盡殺絕”這一策略的核心就是盡可能地將潛伏的HIV趕出來并殺滅，如何充分地活化機體內全部的病毒儲存庫，如何更有效地殺滅被活化的細胞，是未來研究值得關注的熱點。以SAHA為代表的HDACi在體外實驗中均顯示出對潛伏HIV程度不等的激活效果，一些正在進行的臨床研究項目僅對其激活HIV儲存庫的效果進行初步評估，但未獲得十分令人滿意的結果，這可能與各研究所采用的HDACi給藥頻率不當和療程不足有關。同時，使用HDACi激活病毒儲存庫時應注意評估健康CD4+T細胞被活化的HIV繼發感染問題，因為已有研究表明，現有療效欠佳的SAHA給藥方案增強了未感染的CD4+T細胞對HIV的易感性，甚至可能有助于再次建立新的病毒儲存庫[25]。因此未來須要進一步優化HDACi的給藥頻率和療程，并聯合其他免疫治療措施，以期實現功能性治愈的目標。

2 早期治療策略

“密西西比嬰兒”和法國VISCONTI隊列的結果提示，在HIV原發感染的早期啟動cART的治療策略有可能實現功能性治愈。“密西西比嬰兒”的母親為HIV感染者，但未行母嬰阻斷，該嬰兒出生后檢測HIV RNA及HIV DNA均陽性，出生后30 h便接受了cART治療，于18月齡時中斷ART。患兒30月齡時復查外周血HIV RNA和外周血單個核細胞內HIV DNA均檢測不到，CD4+/CD3+比例維持在40%以上，HIV特異性抗體陰性[5]。該患兒的成功治療證明早期治療尤其在嬰幼兒時期，可能是實現HIV功能性治愈的方法。最近，加拿大研究人員對136例HIV感染的母親所生的新生兒在出生72 h內啟動cART。136例中有12例（8.8%）為垂直感染，其中有4例實現了持續病毒學抑制，其HIV抗體、HIV-1特異性細胞介導的免疫應答（Nef,Gag）和超敏病毒載量檢測均為陰性。富集的CD4+T細胞中未檢出HIV DNA，但可檢出HIV RNA。CD4+T細胞［（5.4～8.0）×106CD4+T細胞］在促有絲分裂刺激之后也未檢測到病毒相關的HIV RNA，但2例中有1例患兒通過更高數量細胞的定量共同培養檢測到有復制能力的病毒（0.1感染單位/106CD4+T細胞）[26]。這4例患兒仍未中斷ART，尚不能確定是否實現了功能性治愈。

“密西西比嬰兒”最初宣布功能性治愈時，許多學者認為該患兒在啟動ART時病毒儲存庫尚未建立，然而最近“密西西比嬰兒”在停藥后第27個月血漿中又可檢測到HIV RNA，已宣告HIV復發，這不僅反映出該患兒治療時HIV病毒儲存庫已經形成，而且提示病毒儲存庫建立的時間可能比想象的更早。新近動物研究表明，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）潛伏感染病毒儲存庫在感染的極早期、出現病毒血癥之前就已形成[27]。而目前cART是在檢測到血漿HIVRNA后才啟動，且藥物在體內達到有效抑制病毒復制的濃度也需要時間，在此時間窗內病毒儲存庫可能已經穩定建立。早期ART雖不能阻止病毒儲存庫的建立，但可以減小病毒儲存庫的大小[28]。因此對于急性HIV感染者無論是成人還是兒童，cART的啟動可能越早越好。

在成人HIV感染的早期治療方面，法國VISCONTI隊列的164例成人HIV感染者在感染后10周內啟動了cART，有15%的患者中斷治療后2年血漿HIV RNA檢測不到[29]，14例中斷治療后仍可維持血漿HIV RNA低于檢測線的平均中位時間達4.5年[30]，但14例仍可檢測到HIV DNA，說明早期ART可以實現功能性治愈。研究者還分析了病毒儲存庫在CD4+T細胞亞群中的分布特征，發現長壽的中央記憶型（centralmemory，TCM）和初始（na?ve，TN）CD4+T細胞在病毒儲存庫中所占的比例比精英控制者低[29]。盡管如此，該隊列中接受早期抗病毒治療的大部分HIV感染者并未實現功能性治愈，這從另一個側面說明cART啟動的時間可能須要進一步提前，并且可能須聯合其他治療方法。

總之，急性HIV感染的嬰兒和成人病例難以在成人HIV感染者中大范圍復制，除了對那些HIV暴露后及早尋求干預的人外，絕大多數都是慢性HIV感染者，其已經喪失了早期治療的機會，因此有必要尋找其他更有效的治療途徑。

3 骨髓移植和基因敲除策略

“柏林病人”的治療成功證明了骨髓移植是實現HIV功能性治愈的途徑。然而因為正常人群中攜帶CCR5△32/△32純合子基因的比例極低，尋找一例既攜帶該基因又能與患者骨髓配型吻合的供體幾率更低，因此這種方式也不適合在HIV感染人群中大范圍推廣。美國研究者曾對2例患者嘗試用野生型CCR5（+）的供體進行異基因造血干細胞移植（波士頓病人）[31]。雖然在移植后第24～42個月使用ART期間，其外周血單個核細胞、CD4+T細胞和血漿中均檢測不到HIV RNA和HIV DNA[31]，但在中斷ART后3～7個月均檢測到血漿HIVRNA反彈[32]。這不但表明攜帶CCR5△32基因的干細胞是移植治療策略的關鍵，也表明對那些似乎實現功能性治愈的患者需要更長時間的監測。

目前研究人員正在模擬“柏林病人”案例的方式，用基因改造的方法將干細胞或CD4+T細胞CCR5基因敲除，使其具有抵抗HIV感染的能力，再回輸到患者體內，并期望這些具有抗病毒能力的細胞能夠在患者體內成活[33-36]。雖然CCR5基因敲除的T細胞移植相對安全，但其缺點在于細胞壽命相對較短，其體內半衰期為48 d[33]，因此可能有必要反復進行移植，增加了風險和費用。CCR5基因敲除的多能干細胞可被誘導分化，也具有抵抗HIV感染的能力，可能具有更佳的臨床應用價值[37]。常用的基因改造方法有鋅指核酶技術、轉錄激活因子效應物核酶技術和CRISPR/Cas9系統[33,38-39]。這些技術不只用于敲除CCR5基因，也可直接剪切細胞內整合的HIV前病毒。體外研究表明LTR靶向的CRISPR/Cas9系統不但可以100%地清除潛伏感染細胞中整合的HIV DNA[40-41]，還可以阻止其再次被HIV感染[41]。

盡管這些基因改造技術均須在體外進行，尚不能在體內實現CCR5基因敲除和細胞內整合的HIV DNA的剪切，但其不但適用于急性HIV感染者，也適用于慢性HIV感染者，并為HIV的個體化治療奠定了基礎。隨著未來研究的不斷深入，其不失為一種極具潛力的治療策略。

4 免疫治療策略

精英控制者之所以能控制病毒庫產生的新病毒，是依賴體內存在足夠數量的HIV特異性CD8+T細胞以及較小的病毒儲存庫[22,42-43]。免疫治療策略通過增強機體對潛伏感染細胞的特異性免疫應答清除這些細胞。增強機體抗HIV免疫應答的治療性疫苗可有助于實現對病毒儲存庫的控制。最近一種SIV治療性疫苗在SIV感染的恒河猴模型上獲得了成功。研究人員給予其接種表達SIV蛋白的恒河猴巨細胞病毒載體疫苗，此后再用致病性SIV感染動物，50%的動物在出現一過性病毒血癥后，外周血病毒載量持續下降直至檢測不到水平，隨時間延長這些動物組織中甚至檢測不到SIV RNA和SIV DNA，也檢測不到有復制能力的SIV，說明該疫苗不能阻止病毒感染，但可以清除病毒[44]。目前HIV疫苗的臨床試驗尚未獲得滿意的結果。HIV疫苗ALVAC-HIV和AIDSVAX B/E的臨床試驗表明其雖能阻止31%的HIV感染，但不能影響HIV感染者的疾病臨床進程[45]。另一項HIVDNA疫苗的臨床試驗表明疫苗可刺激產生多功能的、廣譜的HIV特異性CD8+T細胞群，但并不能減少病毒儲存庫[46]。另一種HIV-1 p24亞單位疫苗Vacc-4x在90%的接種者中誘導了特異性T細胞免疫應答并降低了病毒載量，免疫接種7年后，仍分別有95%和68%的個體存在特異性的CD4+和CD8+T細胞應答，中斷ART的中位時間為2.2年[47]。目前研究者正嘗試聯用RMD和Vacc-4x進行功能性治愈的臨床研究。

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors,CARs）是另一項免疫治療策略。它將單克隆抗體的抗原結合基序與T細胞受體的信號轉導基序結合，通過基因工程技術使其在T細胞表達，恢復T細胞靶向性結合HIV的能力并發揮免疫效應。有報道稱98%接受這種基因改造的T細胞回輸的患者在輸注后11年體內仍可檢測該T細胞[48]。CARs通過結合不同信號轉導基序可以增強細胞毒性、增殖和生存能力[49]，該方法可用于“kick and kill”策略里的第2個環節輔助殺傷激活的病毒儲存庫。

綜上所述，HIV/AIDS不再是一種無法治愈的疾病，在長期cART基礎上聯合以上方法，可以實現HIV功能性治愈。然而現有的數據也提示我們，病毒儲存庫可能遠比我們想象的要大，現有的病毒儲存庫的檢測方法還難以準確評估病毒儲存庫的大小和分布，另外缺乏準確判斷患者是否實現功能性治愈及是否可以停用cART的確切指標。在實現HIV功能性治愈的道路上我們才剛剛起步，這條道路充滿希望，但也不是一帆風順，未來多種策略的聯合可能才是實現HIV功能性治愈的途徑。

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（2014-08-22收稿 2014-09-12修回）

（責任編委 李軍 本文編輯 陳玉琪）

Functional cure for HIV:the approaches and challenges

KANGWen,WANG Chun-fu,SUN Yong-tao*
Department of Infectious Diseases,Tangdu Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi710038,China
*

,E-mail:yongtaos@hotmail.com

HIV can integrate into the infected cells'genome and persist in a stable latent reservoir in a resting state.Although combined antiretroviral therapy(cART)can successfully control HIV-1 replication,the latent reservoir is unaffected by ART.ART is a lifelong treatment with side effects for the individuals infected with HIV-1.Moreover,it is also a great financial burden for the world health system.A functional cure for HIV is a sustained post-treatment remission,which shows sustained viremia controlling and re-established immune function without ART.Although HIV reservoir is hardly to be eradicated,a functional cure can be achieved by several approaches,at least for a small proportion of infected people.Recently,several approaches including"kick and kill",early treatment,genetic and immune intervention are being explored to reach the aim of functional cure for HIV.Current studies havemade some progresses,butmany challenges still exist.A combination of these strategieswill be the approach to achieve the goal.

acquired immunodeficiency syndrome;HIV;therapeutics

R512.91；R373.51

A

1007-8134(2014)06-0328-06

國家“十二五”科技重大專項（2014ZX10001002）

710038西安，第四軍醫大學唐都醫院傳染科（康文、汪春付、孫永濤）

孫永濤，E-mail:yongtaos@hotmail.com