獨角蓮中酪氨酸酶活性抑制成分的提取工藝研究

宋艷玲， 杜新春， 龐 穎， 殷連保， 張 毅， 戴宏斌

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

獨角蓮(TyphoniumgiganteumEngl.) 為天南星科(Araceae) 犁頭尖屬(Typhonium Schott) 植物,是中國特有的一種植物，主要產于河南、四川、陜西等地，現全國各地亦多栽培，東北地區產量極高，且價格較低廉.《民間草藥》、《中藥大辭典》記載，獨角蓮球莖供藥用，逐寒濕，祛風痰，鎮痙，治中風痰壅、口眼歪斜、破傷風、跌打損傷、淋巴結核[1].迄今為止，對這種植物的使用多用于民間偏方，其有效活性成分的研究及應用仍處于開發階段.文獻報道，獨角蓮水提物對惡性腫瘤細胞增長具有明顯的抑制作用[2-5].酪氨酸激酶在細胞內的信號傳導通路中具有十分重要的作用，它和腫瘤的發生、發展、轉移具有密切的關系，成為目前抗腫瘤藥物的重要研究靶點[6-7].本實驗對獨角蓮采用水提法提取，測定獨角蓮在不同提取工藝條件下的提取物對酪氨酸酶活性的相對抑制率,從中篩選出最佳的提取工藝.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗儀器

721型分光光度計；DF1015-集熱式磁力加熱攪拌器；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵；電子分析天平.

1.2 實驗材料

獨角蓮鮮球根莖(市售，產地為吉林)洗凈，切成約5 mm的厚片， 經50 ℃烘干，粉碎,過100目篩，備用；L-酪氨酸(上海伯奧生物科技有限公司)；酪氨酸激酶(上海江萊生物科技有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 獨角蓮水提物的提取工藝研究

利用正交試驗設計法，選取提取時間A、料液比B、提取溫度C、提取次數D作為4個考察因素，每個因素選擇3個水平，按照L9(34)正交表(表1)進行試驗.以1號實驗為例，稱取獨角蓮粗粉50 g，置圓底燒瓶內，用5倍質量比的蒸餾水，在50 ℃提取1 h，提取次數1次.提取結束后，將提取液減壓濃縮至干,置烘箱中干燥至恒質量,得干浸膏.其余試驗按正交表設定的條件依次進行.

表1 獨角蓮水提物提取的正交試驗設計

1.3.2 酪氨酸酶抑制活性測定

Folin試劑可與酪氨酸的酚羥基作用生成深藍色化合物，該物質可以用比色法測定.酪氨酸如果被酪氨酸激酶分解，將不能與福林試劑發生顯色反應，通過分光光度計測得的混合液的吸光度會有所降低.由于酶抑制劑的抑制活性不同，所形成的藍色化合物量不同，通過測定吸光度的變化可計算樣品對酪氨酸酶的抑制率.將上述各次提取實驗所得到的浸膏分別稱取10 mg置于10 mL容量瓶中，分別加蒸餾水溶解并稀釋至質量濃度為1 g/L，備用.取1 mg酪氨酸酶用磷酸緩沖液稀釋至5 mL備用.準確吸取pH6.8磷酸鹽緩沖液1 mL、摩爾分數為0.2 %酪氨酸溶液1 mL及Folin試劑，開始反應，整個反應在37 ℃的恒溫中持續20 min，于680 nm 處測定吸光度A0.在上述實驗條件下，再分別準確吸取0.2 g/L酪氨酸酶試液1 mL、提取物樣品和0.2 g/L酪氨酸酶試液各1 mL、提取物樣品1 mL，分別進行反應后對應測定吸光度分別為A1、A2、A3.酪氨酸激酶的抑制活性可以按以下公式計算:

抑制率=[(A1-A0)-(A2-A3)]/(A1-A0)×100 %

式中:A0空白對照品所測的吸光度;A1添加酪氨酸酶混合液所測的吸光度;A2添加提取物和酶的混合液所測的吸光度;A3添加提取物樣品混合液所測的吸光度.

2 結果與討論

2.1 正交試驗結果

正交試驗結果見表2，從表2 得出最佳提取工藝條件為A3B3C2D1，即提取時間為3 h，料液質量比為1∶15，提取溫度80 ℃，提取次數為1次的條件下，獨角蓮提取物對酪氨酸酶抑制活性較高.從表2中得到的極差大小可知:影響提取物抑制酪氨酸酶活性的主次因素順序為C>B>D>A，即提取溫度的影響最顯著，其次為提取液用量，再次為提取次數，最后為提取時間.

按照正交試驗結果所得到的最佳提取工藝條件，重復進行3組平行驗證試驗，結果見表3，表明此提取工藝合理，穩定，可行.

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗結果驗證

2.2 討 論

正交試驗結果表明：提取溫度的控制對提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較大.溫度較低(50 ℃)情況下，有可能不利于獨角蓮中有效活性成分的提取，影響提取物抑制酪氨酸酶活性.溫度過高(100 ℃)，提取物抑制率也有所下降，可能是由于高溫使得部分活性化合物分解.提取液用量在料液質量比1∶5與1∶10之間對提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較大，而對于料液質量比1∶10與1∶15之間對提取物抑制酪氨酸酶活性的影響較微弱，一般情況下，可選用料液質量比1∶10來減少資源的浪費.

3 結 論

設計正交試驗,利用水提法對獨角蓮活性成分進行提取,并進行了酪氨酸酶抑制活性研究.結果表明：提取時間為3 h，料液質量比為1∶15，提取溫度80 ℃，提取次數為1次的條件下，獨角蓮水提物抑制酪氨酸酶活性最強，抑制率為46.93 %.通過3組平行試驗驗證了該提取工藝的優化性.獨角蓮水提物作為一種有效的酪氨酸酶抑制劑，具有進一步研究開發的價值.

參考文獻：

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