空氣微生物污染的監測及研究進展

陳 鍔，萬 東，褚可成，許淑青，張 寧

甘肅省環境監測中心站，甘肅 蘭州 730020

環境空氣中污染物包括了固態(大氣顆粒物)、氣態(SO2、NOx等化學污染物)和微生物。而環境空氣中的微生物大多又附著在灰塵粒子上[1]，或者由微生物產生的孢子飄浮在大氣中形成新的氣溶膠粒子，并借風力向四處擴散和傳播。

大氣污染物對人體健康的影響十分復雜，而影響健康的主要環境因素有化學、物理和生物性等。其中化學因素早已為人們所重視，國內空氣污染研究的關注焦點多是理化性質方面，如TSP、PM10、PM2.5、煙粉塵、沙塵氣溶膠[2]、SO2、NOx、光化學煙霧等，而同樣對人類健康有較大影響的空氣微生物問題則關注較少。近年來，隨著非典型肺炎(SARS)、禽流感(AI)等傳染性疾病的跨區域傳播，生物性污染事件不斷出現，僅2003年，全球SARS累計報告病例8 098例，774人死亡，中國累計感染就達5 327例，349人死亡[3]。而2009年以來，禽流感在全球的蔓延，也已致使上千人死亡。隨著人類對健康和環境問題的日益關注，一個城市或一個區域的空氣微生物污染狀況，必將成為衡量和評價這一城市或區域環境空氣質量的一項重要指標。

1 空氣微生物及污染現狀

空氣微生物包括細菌、霉菌、放線菌、病毒、孢子和塵螨等有生命活性物質的微粒，主要以微生物氣溶膠的形式存在于大氣環境中，也是城市功能區生態系統重要的生物組成部分。微生物氣溶膠是指懸浮于空氣中的微生物所形成的膠體體系。微生物氣溶膠的粒徑一般為0.002～30 μm，包括分散相的微生物粒子和連續相的空氣介質。與人類疾病有關的微生物氣溶膠粒子直徑一般為4～20 μm，而真菌則以單個孢子的形式存在于空氣中。不同微生物氣溶膠粒徑大小不同：細菌0.3～15 μm，真菌3～100 μm，孢子6～60 μm，病毒 0.015～0.045 μm，藻類0.5 μm，花粉1～100 μm[1]。目前，已知存在空氣中的細菌及放線菌有1 200種，真菌有4萬種[4]；大部分是對較干燥環境和紫外線具有抗性的種類，主要有附著于塵埃上的球菌屬(包括八疊球菌屬在內的好氧菌)、形成孢子的好氧性桿菌(如枯草芽孢桿菌)、青霉等霉菌的孢子等。影響微生物氣溶膠總量的因素主要有微生物的群落種類與結構、氣溶膠膠化前的懸浮機制以及各類環境因素[5]。微生物氣溶膠在空氣中停留的時間長短由風力、氣流和雨、雪等條件所決定，但它們最終都要返回到地表的土壤、水體中以及建筑物和動植物表面。因而，空氣微生物不但與環境空氣質量、空氣污染和人體健康密切相關，并且還與自然生態平衡及許多生命現象直接相關，在自然界的物質循環中起著非常重要的作用[6-7]。

空氣微生物主要來源于自然界的土壤、水體、動植物及人類自身。此外，與人類生產生活相關的養殖場、屠宰場、垃圾處理廠、污水處理廠、發酵釀造廠、食品生產廠等場所也是空氣微生物的重要來源[8-11]。空氣中的微生物主要是非病原性腐生菌，各種球菌占66%，芽孢菌占25%，還有霉菌、放線菌、病毒、微球藻類、蕨類孢子、花粉和少量厭氧芽孢菌[12]。但受到各種環境因素的影響，不同地區空氣微生物種類也不盡相同[13]。空氣微生物還可能隨著生存環境的變化而發生變異，大氣中嚴重的物理化學污染(如粉塵污染)可以為微生物提供載體，擴大其傳播范圍[3]。空氣傳播微生物而引起呼吸性疾病的能力主要依賴于微生物依附的空氣中的固體顆粒大小[14]，空氣固體顆粒物大小在一定程度上也是影響空氣微生物污染現狀的重要因素。

值得關注的是，由于人體呼吸道的生理結構特殊、表面積大，空氣中的病原微生物粒子會通過人的鼻、咽、喉、氣管、支氣管進入到肺泡，引起相應部位感染。以成人為例，肺泡約有3億個，總面積70 m2(人體體表面積的40倍)，呼吸系統的這些生理結構特征導致人體易受空氣中病原微生物的感染。同時，空氣的流動性和擴散性使病原微生物氣溶膠四處擴散，可在短時間內產生大量病例[15]。因此，對空氣微生物開展研究與監測，能有效預防危害公共衛生環境事件的發生，有機地將環境監測與公共衛生結合起來，更加有力地說明空氣微生物污染對環境的具體影響程度、影響范圍以及影響結果，更好地為環境管理與決策提供技術依據。

2 空氣微生物的采樣方法

空氣微生物采樣方法主要有2種：一種是自然沉降法，是德國細菌學家Koch于1881年建立的，是指利用空氣微生物粒子的重力作用，在一定時間內，讓所處區域空氣微生物顆粒逐漸沉降到含有培養基質培養皿內的采樣方法[5]；另一種是氣流撞擊法，是利用采樣器的抽氣動力來完成采樣。按照采樣器的原理，可分為撞擊式、離心式、氣旋式、過濾式、靜電式等[16]。在環境監測過程中，應依據不同的研究目標選擇不同的采樣器，用不同的采樣方法監測空氣微生物的結果會有一定的差異[17-18]。研究表明[19]，空氣微生物采樣過程的影響因素很多，自然沉降法以其采樣簡單而被廣泛應用，但也有研究表明這種采樣方法準確度較差，不能反映微生物的真實數量[20]。相比較而言，撞擊式采樣器采集空氣微生物以其穩定性、準確性好而被推廣使用[21]。以目前最為常用的安德森六級篩孔撞擊式空氣微生物采樣器(以下簡稱ANDERSEN采樣器)為例，其模擬人體呼吸道的解剖結構及其空氣動力學特征，采用慣性撞擊原理，將懸浮在空氣中的微生物粒子，按大小等級分別收集在采樣培養基表面，求出空氣微生物粒子的數量及其大小分布特征，提前掌握可能會對本地區環境產生污染問題的空氣微生物種類及數量，從而有針對性地做出預防和治理。胡慶軒等[22]對ANDERSEN采樣器法、LWC-1型采樣器法和平皿沉降法3種空氣微生物采樣方法進行的比較實驗表明，ANDERSEN采樣器的采樣效率高，可以同時測定空氣微生物粒子的濃度和粒子大小分布，是觀測和研究空氣微生物的首選采樣器。

3 空氣微生物的粒度分布

粒徑尺度是空氣微生物的一個重要參數，它關系到微生物在空氣中的存活、沉降、空間分布、傳輸和在人呼吸系統中的沉積，也是開展空氣微生物污染監測研究的重要方式，通過對空氣微生物粒度分布的研究，可以將生物學、醫學、氣象學、物理學等多種學科交叉綜合起來共同說明相關環境問題，進而闡明此類環境問題對人類健康的影響。空氣微生物氣溶膠的粒子尺度及分布狀況研究正受到廣泛關注，眾多研究者對環境中的微生物氣溶膠粒子的大小進行過測定，不同地區不同研究人員用不同方法測出的微生物氣溶膠粒徑結果各異。空氣微生物是個群體概念，本身就超過50萬種，因此，微生物氣溶膠粒譜范圍也很寬，粒徑分布范圍為0.002～ 30 μm[1]。胡慶軒等[23]采用ANDERSEN采樣器測定京津地區空氣中細菌和真菌的粒度分布，研究結果顯示：北京西單大于2 μm的空氣細菌粒子占83%，大于8.2 μm的粒子占29.8%；北京豐臺空氣真菌峰值中心位于3～6 μm，小于8.2 μm的真菌粒子占64.3%；對沈陽市大氣真菌粒數中值直徑及粒度分布的研究結果表明，沈陽市大氣真菌粒子年平均粒數中值直徑為3.9 μm。四季中，大氣真菌粒數中值直徑夏季較大，冬季較小，分別為4.2 μm和3.6 μm。小于8.2 μm的所吸入大氣真菌粒子占88.4%，對人體直接造成危害[19]。李能樹采用ANDERSEN采樣器對合肥市大氣微生物的粒度分布的研究發現，大氣中細菌的粒度分布在春、秋季較高，真菌粒子則多在3.0～6.0 μm和2.0～3.5 μm范圍[24]。張朝隆等[25]對北京307醫院外環境空氣細菌粒度分布的測定表明，大于4.7 μm和3.3～0.65 μm 2個范圍捕獲的粒數分別占69.9%和30.4%。空氣中微生物粒子的粒度分布以小于8.2 μm的居多，而根據有關研究，空氣中與疾病有關的帶菌粒子直徑一般為4～20 μm[1]。不同粒子大小的微生物顆粒進入人體呼吸系統的位置不同，對人體的危害不同，10～30 μm 的粒子可進入鼻腔和上呼吸道；6～10 μm的粒子能沉著在次支氣管內，1～5 μm的粒子可進入肺深部[26-27]。

4 空氣微生物的分離鑒定

對采集到空氣微生物的分離鑒定有培養基方法和非培養基方法2種。培養基法是傳統的空氣微生物檢測方法，即將采集到的空氣微生物倒置培養，長成菌落后計數，然后進行分離和純化，并鑒定種屬。鑒定方法主要有16SrRNA序列分析、核酸分子雜交、DNA的G+C含量分析、質譜、色譜分析及免疫學方法與光學計數相結合的全自動分析方法[28]。周煜等[29]將16S rRNA序列分析法應用到空氣微生物檢測中，該方法具有快速、準確和不依賴于細菌生長狀態等優點，實驗證明，16S rRNA序列分析法可以作為空氣微生物分析的一個有效技術。不足的是，培養基法只能監測到在培養基上生長的微生物，需要花費大量的人力和精力，而環境中只有部分微生物是可培養的，通過培養基法只能監測到空氣中的部分微生物[30]。非培養基法是指采樣后不經過培養就直接進行計數鑒定的方法，主要有熒光顯微鏡、電子掃描顯微鏡、流通式血球計數、PCR檢測法等檢驗方法。其中，PCR檢測法具有靈敏度高、特異性強、鑒定周期短等特點，能夠檢測環境空氣中較多的微生物，尤其是定量PCR(qPCR)，不僅具有上述優點，還可以實現對DNA和RNA的定量分析。Haugland等[31]用qPCR檢測了微生物氣溶膠，證明qPCR可以快速定量空氣中某種微生物氣溶膠的濃度。近年來，變性梯度凝膠電泳(DGGE)、DNA芯片技術、末端限制性酶切片段長度多態性分析(T-RELP)等技術也在空氣微生物研究中得到應用[32-33]。非培養基法的發展促使鑒定出更多的空氣微生物，為掌握空氣中微生物的時空變化提供技術支撐[34-37]。

5 空氣微生物的監測評價

空氣的微生物監測通常采用營養瓊脂平板計數法評價空氣的清潔程度。測定的微生物指標有細菌、霉菌和放線菌總數，在必要時則測病原微生物。空氣中微生物數量及種類因污染源及污染程度不同而異。空氣污染物多以氣溶膠形式存在，其中的微生物氣溶膠不但可以污染食品和水源，而且人類很多疾病就是通過空氣微生物直接傳染。空氣中微生物污染情況的檢驗，一般以細菌和真菌作為檢測目標，在許多行業中備受重視。

空氣微生物的污染程度要以量化的數據形式來得以體現，以便人們對空氣微生物的污染程度進行質量評價。

5.1 自然沉降法

計算平均菌落數通過奧梅梁斯基公式(1)換算為所測單位體積空氣中的各類微生物菌落數[38-39]。 奧氏認為，5 min內落在面積100 mm2營養瓊脂平板上的細菌數和10 L空氣中所含的細菌數相同。

(1)

式中：n為空氣微生物濃度，cfu/m3；N為平均菌落數，個/皿；經過培養后牛肉汁蛋白胨瓊脂培養基的細菌菌落數+馬丁培養基的霉菌菌落數、放線菌菌落數+高滲透壓培養基的耐高滲透壓霉菌菌落數[40]；A為平皿面積，cm2；t為平皿暴露于空氣中的時間，min。 空氣微生物的測點數越多越準確，為照顧到工作方便，又相對準確，以20～30個測點數為宜，最少測點數為5～6。

5.2 氣流撞擊法

以ANDERSEN采樣器為例，將采樣后的平皿倒置于37 ℃恒溫恒濕箱中48 h，對有特殊要求的微生物則放相應條件下培養，計算各級平皿上的菌落數，一個菌落即是一個菌落形成單位(cfu)。以1 m3空氣中所含粒子數量表示空氣中微生物數量，公式：

n=(N×1000)/ (t×V)

(2)

式中：n為空氣中微生物數量，cfu/m3；N為所有平皿菌落數，個；t為采樣時間，min；V為空氣流量，L/min。以各級的菌落數占六級總菌落數百分比表示空氣微生物大小分布，即各級微生物粒子數(%)=該級菌落數×1 000/六級總菌落數量。

采用中科院生態中心推薦使用的空氣微生物評價標準(表1)[41]對空氣微生物污染狀況進行評價。

表1 空氣微生物評價標準 103 cfu/m3

6 空氣微生物污染的研究

細菌的濃度隨著地域和時間的變化呈一定的變化，城市與鄉村或同一地區不同功能區、季節和月份的變化等都對細菌氣溶膠的濃度有影響[42]。從相關研究來看[43-46]，空氣微生物的種類分布主要以抵抗力較強的革蘭氏陽性菌為主，包括球菌、桿菌和芽孢桿菌等，革蘭氏陰性菌較少。空氣微生物中的真菌優勢種包括：枝孢屬(Cladosporium)、鏈格孢屬(Alternaria)、鏈孢霉屬(Fusarium)、無孢屬(non-sporulatingmycelia)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、芽枝霉(Blastocladiapringsheimii)、互隔交鏈孢霉(Altemariaalternata)[13,47-50]。

6.1 空氣微生物的時間分布特征

不同地區，空氣微生物的濃度會隨著季節、月份和每日不同時段的變化而變化。研究資料表明[51-53]，一年中的空氣細菌變化曲線呈雙峰型，2個高峰，一般夏、秋季高于春、冬季。從每日時段變化來看，17:00至18:00細菌濃度較高，8:00、1:00至2:00時細菌濃度較低。

6.2 空氣微生物的空間分布特征

一天內，空氣中微生物氣溶膠濃度受不同地區的人員流動、車輛活動、綠化覆蓋率、近地面溫度和紫外線輻射等影響，溫度升高可使近地面風速發生變化，從而破壞空氣的穩定程度，使空氣底層的帶菌顆粒垂直上升而稀釋；日輻射強度的增加，使得紫外線能夠對細菌起到殺滅作用[54]。不同地區的空氣微生物污染具有一定的空間分布差異，詳見表2。

表2 不同地區室外空氣微生物污染空間分布差異

同一城市不同功能區的微生物濃度也有很大區別。研究顯示，商業區、交通區細菌污染較重，其次是休閑娛樂區和居民區，文教區污染相對較輕[41,51，58-59]。此外，王文義[60]的研究表明，重慶空氣微生物含量由高到低的順序為鬧市區、縣城區、農村區、山區(對照區)。一般情況下，近地面不同垂直高度空氣微生物的濃度隨著離地面高度的增加，空氣中微生物的數量減少[47]。車鳳翔等[61]進行了不同高度(距離地面高度為1.5、8、15、47、100、320 m)的同步空氣微生物采樣，研究結果表明，不同高度的細菌和真菌濃度隨著高度的增加而減少，尤其47 m以上濃度降低更為明顯。值得注意的是，方東等[62]在研究中發現，空氣微生物含量與空氣監測指標PM10、SO2、NO2的分析結果有一定的相關性，與PM10呈明顯的正相關。謝慧玲等[63]在研究中發現，人流量、車流量與空氣微生物含量呈正相關。

6.3 不同環境中的空氣微生物污染

空氣微生物污染可帶來呼吸道疾病(如軍團病、軍事坑道內的真菌性呼吸道感染)、變態反應(農民肺、棉塵熱、蔗渣塵肺、花粉病、塵螨過敏等)、傷口感染、食品變質等眾多問題[1，64-65]。研究表明，空氣微生物污染是鼻黏膜充血、鼻甲腫大、咽出血及過敏性鼻炎等病癥的主要危險因素，也是影響肺通氣功能及呼吸疾病的重要危險因素，對上海市空氣微生物污染區及清潔區2～5年級小學生254人和268人進行的健康調查表明，污染區兒童鼻黏膜充血、鼻甲腫大、扁桃體腫大、咽出血及過敏性鼻炎的檢出率為清潔區的1.57～6.50倍，空氣微生物污染影響兒童呼吸系統健康[66-67]。

在環境醫學衛生方面，空氣微生物濃度是判斷病房潔凈度的重要指標，病房環境污染的程度是判斷外源性交叉感染的重要依據[1]。衛生部《醫院感染管理條例》就規定，手術室空氣微生物菌數不得超過500 cfu/m3。有學者研究證實，普通手術室的感染率是潔凈手術室的51倍[68]。

7 空氣微生物污染的監測、研究與展望

已開展空氣微生物調查和研究的南、北方省會城市廣州和蘭州，從時間分布、空間分布和空氣中優勢微生物種群3個方面進行比較，歐陽友生等在2002—2003年對廣州市18個監測點空氣微生物的觀察研究顯示，從時間分布看，四季中，廣州市各監測點室外空氣細菌和真菌平均含量變化均表現為春(3 716 cfu/m3)>夏( 2 300 cfu/m3)>冬(1 816 cfu/m3)>秋(1 553 cfu/m3)。因為廣州市的春季正是廣州的梅雨季節，氣候溫暖潮濕，各類微生物易生長和繁殖。蘭州地區空氣微生物數量平均值：春(20 983 cfu/m3)>秋(16 196 cfu/m3)>夏(20 329 cfu/m3)>冬(13 351 cfu/m3)[69]。但從筆者目前對蘭州地區不同季節空氣微生物的調查研究發現，不同季節里空氣微生物中細菌、真菌、放線菌的含量有一定區別。從空間分布看，廣州市各功能區的空氣微生物平均含量大小順序為：商業步行街>交通樞紐區>居民住宅小區>工業廠區[57]；孫榮高于1990—1994年對蘭州地區25個采樣點大氣微生物的研究表明，大氣微生物總數：交通什字人口密集區>居民商業區>市區>工業區[70-71]。廣州市空氣微生物真菌的優勢種群有青霉屬(Penicillium)、鏈格孢屬(AlternariaNees)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)等[72]，細菌的優勢種群有葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等[54]；蘭州地區空氣中的優勢真菌和細菌分別以交鏈孢霉(Alternaria)、青霉屬(Penicillium)、芽枝霉(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉(Thichoderma)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和八疊球菌(Sarcina)為主[55,73]，南北方會因地形、經緯度、氣候、人口規模、城市綠化、城市結構等因素的差異，空氣微生物的時空變化特征和組成也會有所差異。采用自然沉降法對蘭州市區空氣微生物的調查研究顯示，空氣微生物沉降量會隨著城市發展進程的改變而發生變化，適時開展空氣微生物定點監測對于掌握本地區環境空氣質量和空氣污染狀況的變遷歷程有著積極的意義[55，74]。

目前，我國對空氣微生物進行的研究大多集中在調查方面，還未形成有效的研究體系，有許多方面的問題還有待進一步研究。如在微生物監測方面：一是應增強和加大空氣微生物采樣、鑒定新方法、新技術的研究和研制，使用采集效率更高效、更合理的空氣微生物采樣器。二是利用更加先進的分子生物學等手段來對空氣微生物的種類進行分離鑒定。三是結合對大氣灰霾的污染，開展大氣細顆粒或超細顆粒物中微生物樣品采集和研究。由于灰霾是以細顆粒物為載體，主要成分有硫酸鹽、硝酸鹽、銨鹽、含碳顆粒(包括元素碳和有機碳)、重金屬等[75]，空氣微生物是否可以利用細顆粒中的營養基質，通過自身代謝來提高相關元素或化合物的毒性(如將元素汞轉變成烷基汞)，從而加劇空氣微生物污染影響程度。四是將環境微生物監測向常態化和在線監測方向發展和延伸。不能僅局限于微生物數量和種類的簡單監測，而要系統地研究空氣微生物群落結構及其動態變化的影響因素，應將空氣微生物進行有效分離、鑒定，充分揭示空氣微生物污染的程度和對人體健康的危害，為制定相應的預防措施提供理論依據。另外，對微生物氣溶膠污染傳播機制的研究也較欠缺，尤其是關于感染性微生物氣溶膠在不同環境中的傳播機制的實驗研究較少，大部分是模擬研究，缺少連續的基礎監測數據和實驗研究的證據[76]，因此還需加強微生物氣溶膠傳播途徑及機理的研究和空氣微生物毒理學的研究，全面研究空氣微生物的動態變化規律及其對人類健康乃至整個生態系統的影響。有害微生物作為空氣中活的污染物，隨著人類社會的發展，其對空氣質量的不良影響也在逐漸得到人們的認識。空氣微生物作為一種特殊污染物，應與PM10、SO2、NO2一樣，獨立作為一種空氣污染物被日常監測和控制。

此外應加強對空氣微生物的監測和研究，開展與理化污染物同步的空氣微生物監測，及時掌握本地區空氣微生物污染狀況、污染源和變化規律，及時發現重點污染源，盡早采取治理措施，避免大規模污染事故的發生和蔓延[71]。

8 結語

近年來，隨著民眾對霧霾、揚塵等污染天氣問題的日益關注，空氣微生物對人體健康和大氣污染的影響問題愈加顯得重要。要從根本上解決此類問題，首先要開展空氣微生物的常規監測，用積累的大量監測數據，為研究其形成原因提供翔實資料，這也為研究霧霾和顆粒物污染的成因、機理及遷徙途徑提供十分重要的技術支持。對于空氣微生物的監測，主要是通過采集TSP、PM10、PM2.5樣品來達到。而目前在TSP、PM10、PM2.5樣品的日常監測中，多數只是停留在常規項目的理化分析，而對其中空氣微生物的研究甚少。這些受污染的大氣顆粒物中，空氣微生物的污染到底達到何種污染狀況、范圍和程度，霧霾、揚塵等環境惡化天氣是否對人體健康造成危害，或者說造成哪些危害，尚待進一步研究。希望國家能盡早出臺我國的空氣微生物標準監測規范，提前防范和降低空氣微生物污染對人體健康的危害。

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