熒光法測定蒜頭果蛋白中Trp的含量

袁 燕，張 薇，戴建輝，陳磊，錢吉花，殷兆福

(云南民族大學(xué) 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500)

色氨酸(Trp)是食物中含量較少且在體內(nèi)又無法自行合成的“必需氨基酸”，它對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸[1].色氨酸測定方法主要有紙層析法、熒光法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳、酶/比色法以及酶電極法等[2-3].由于Trp在受到紫外光照射后，會產(chǎn)生比激發(fā)波長更長的熒光信號，所以利用Trp的熒光特性，可以用簡便、快捷、高靈敏度的熒光光譜分析方法來檢測Trp的含量[4].

蒜頭果(MalaniaoleiferaChunet S. Lee)屬于鐵青樹科蒜頭果屬[5]，是中國特有單種屬稀有植物，國家二級保護(hù)樹種，廣西重點保護(hù)野生植物[6-7].蒜頭果蛋白(malanin)是從云南廣西特有植物蒜頭果中分離、純化出的一種新的、具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)[8]，該蛋白是一種糖蛋白，相對分子質(zhì)量為 61 875，由A、B兩條鏈通過二硫鍵連接而成.由于在通常的氨基酸分析中一般都使用酸水解蛋白質(zhì)，但是在酸水解條件下，Trp極易被破壞，故在氨基酸分析測定中無Trp的含量數(shù)據(jù)，而需要單獨測試[9].本研究以NaOH為水解液，利用熒光法測定malanin中Trp的含量，為malanin全序列的測定提供參考數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

malanin由本課題組制備；L-色氨酸為上海生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；所有水均為Milli-Q純水.

1.2 儀器

F-4500熒光分光光度計(HITACHI公司)；Milli-Q純水機(MILLIRORE公司)；萬分之一天平(Sartorius, BP110S).

1.3 實驗方法

1.3.1 Trp標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

準(zhǔn)確稱取色氨酸10 mg，加蒸餾水溶解，定容至10 mL，此溶液質(zhì)量濃度即為1 mg·mL-1.在7支試管中分別加入1 mg·mL-1Trp溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.25、0.30和0.35 mL，再用pH=10.5的KH2PO4- NaOH緩沖液定容至5 mL，則Trp標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.00、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg·L-1.

1.3.2 熒光光譜測定

選用激發(fā)波長225 nm，在290～450 nm掃描熒光光譜，于發(fā)射波長350 nm處讀取熒光強度值.激發(fā)光譜狹縫寬度為5 nm，發(fā)射光譜狹縫寬度為10 nm，高速掃描，以Trp標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10].如圖1所示，可見Trp在0.00～0.07 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好.

1.3.3 Malanin樣品的水解

稱取5 mg malanin于水解管內(nèi)，加入新配制的含0.5%可溶性淀粉的6.0 mol·L-1NaOH溶液5 mL，向水解管充純氮3 min后封口，在烘箱中110 ℃水解20 h 后，放置于暗處冷卻至室溫[11].

將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至已加有5.0 mL 6 mol·L-1HCl的50 mL容量瓶中，用純水反復(fù)沖洗水解管5～6次后加入l 滴 0. l %的酚酞溶液，然后用6 mol·L-1HCl調(diào)溶液至無色，再用l mol·L-1NaOH 滴定至溶液呈粉紅色，用純水定容.取1 mL樣品于5 mL刻度管中，用pH 10.5的KH2PO4-NaOH 緩沖液定容后搖勻，即為樣品待測液.

1.3.4 樣品中Trp含量的測定

樣品待測液按照1.3.2的實驗方法進(jìn)行，選用225 nm為激發(fā)波長，350 nm為發(fā)射波長進(jìn)行熒光測定.

1.3.5 樣品中Trp含量的計算采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 Trp標(biāo)準(zhǔn)曲線

以Trp標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)得到線性回歸方程為y= 818 9x+24.23 (R2=0.998 5)(圖1).結(jié)果表明，在0.00～0.07 mg·L-1線性范圍內(nèi)，Trp標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與熒光強度呈良好的線性關(guān)系.

2.2 NaOH水解液濃度的選擇

為研究NaOH的水解條件對malanin水解產(chǎn)生Trp量的影響，本研究分別向5 mg malanin中加入5 mL不同濃度的NaOH進(jìn)行水解，其結(jié)果如圖2所示，可見NaOH濃度在5.5～7.0 mol·L-1范圍內(nèi)較好，故本實驗選用6.0 mol·L-1.

2.3 Malanin中Trp的含量測定

根據(jù)回歸方程及含量公式可以計算得出malanin中Trp的含量為5.116 mg·g-1，即每分子malanin中含Trp約為4個.

2.4 檢測限和精密度試驗

在最佳試驗條件下，對0.05 mg·L-1的Trp標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測定8次，由熒光信號強度的標(biāo)準(zhǔn)差的3倍與工作曲線斜率之比，得檢測限為0.002 mg·L-1.對malanin連續(xù)取樣測定8次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.82%.

2.5 樣品重現(xiàn)性和回收率試驗

取5.0 mg左右的malanin樣品6份，按上述水解法處理，儀器條件同上，測定結(jié)果如表1所示.重現(xiàn)性試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05%，結(jié)果表明重現(xiàn)性較好.

在malanin待測液中進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，計算得到的回收率結(jié)果如表2，回收率在96.1%～100.1%之間，說明準(zhǔn)確度較好，達(dá)到了分析實驗的要求.

表1 重現(xiàn)性試驗

表2 回收率試驗

3 結(jié)語

由于蛋白質(zhì)的氨基酸組成測定的水解方法主要是酸水解，同時輔以堿水解.酸水解雖然不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸，但Trp卻完全被沸酸所破壞，羥基氨基酸(絲氨酸及蘇氨酸)有一小部分被分解，同時天冬酰胺和谷胺酰胺的酰胺基也被水解下來.為測定Trp含量，蛋白質(zhì)可用堿水解，雖然水解過程中多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞，并且會產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，所得產(chǎn)物是D型和L型氨基酸的混合物，但Trp在堿性條件下卻是穩(wěn)定的，可以定量回收[12].故本研究以NaOH為水解液，利用熒光法測定malanin中Trp的含量，得出malanin中Trp含量為5.116 mg·g-1，即每分子malanin中含Trp約為4個，此結(jié)果為酸水解測定malanin氨基酸的組成作為補充，同時也為malanin全序列的測定提供較好的參考數(shù)據(jù).

參考文獻(xiàn):

[1] 孫昕. 分光光度法測定豆類及其粗蛋白質(zhì)中的色氨酸[J]. 生物學(xué)雜志, 2000, 17(5):33-35.

[2] 于金龍, 郭長江, 黃英武, 等. 發(fā)酵液中色氨酸含量高通量快速測定[J]. 氨基酸和生物資源, 2008, 30(1)：70-71.

[3] 高春, 周淑平, 李群, 等. 18種復(fù)合氨基酸注射液中N-乙酰-L-酪氨酸及L -色氨酸含量測定方法的研究[J]. 中國生化藥學(xué)雜志, 1998, 19, 3.

[4] 吳芳, 郭衛(wèi)東, 張潤, 等. 熒光法測定微藻中色氨酸的含量[J].海洋科學(xué), 2005, 29(10)：1-4.

[5] 丘華興, 林有潤. 中國植物志(24卷)[M].北京：科學(xué)出版社, 1988, 24.

[6] 傅立國. 中國植物紅皮書——稀有瀕危植物(1冊)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1992：480.

[7] 廣西林業(yè)局保護(hù)站. 廣西壯族自治區(qū)重點保護(hù)野生植物資源調(diào)查報[R]. 南寧, 2001：6.

[8] YUAN Y, DAI X C, WANG D B, et al. Purification,characterization and cytotoxicity of malanin, a novel plant toxin from the seeds ofMalaniaoleifera[J]. Toxicon, 2009, 54：121-127.

[9] 金靜芳, 沈明泉. 熒光法測定羽毛中的色氨酸含量[J]. 氨基酸和生物資源, 1995, 17(4)：27-30.

[10] 任大喜, 提偉鋼, 李景紅, 等. 熒光法測定嬰兒奶粉中色氨酸的含量[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(7)：203-204.

[11] 劉惠容, 張雙峰. 玉米子實中色氨酸的測定[J]. 陜西農(nóng)業(yè)大學(xué), 1987, 3:34-36.

[12] 沈同, 王鏡巖. 生物化學(xué)[M]. 2版.北京:高等教育出版社, 2002：121.