熱激蛋白47在瘢痕疙瘩發病機制中的研究

曾凡杞，樊 超，張志云，黃勇武

(1.深圳市光明新區人民醫院皮膚科，518106 廣東 深圳； 2.深圳市寶安區福永人民醫院皮膚科，518103 廣東 深圳)

瘢痕疙瘩是一種以細胞外基質尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成和降解失衡，導致膠原過度沉積于真皮層的膠原性疾病，其發病可能與遺傳、種族以及免疫等因素有關[1]。熱激蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)是一種促進膠原合成的特異性伴侶分子，在腎小球硬化、腎小管間質纖維化中存在高表達，其可能在腎臟纖維化進程中發揮了重要作用[2]。HSP47在瘢痕疙瘩組織中的表達與膠原的過度沉積是否相關？本研究從這個角度研究瘢痕疙瘩的發病機制，從而為瘢痕疙瘩的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2011年1月至2012年12月到深圳市光明新區人民醫院就診的瘢痕疙瘩患者17例，作為瘢痕疙瘩皮損組，其中男7例、女10例，年齡17～40(21.5±3.0)歲；選擇同期在泌尿外科門診行包皮環切術的11例患者作為正常皮膚對照組，年齡8～35(15.0±2.0)歲。所有患者均無系統性疾病，術前未全身使用免疫抑制劑，未進行局部注射治療，局部無潰瘍等。本研究經醫學倫理委員會批準，所有參加試驗的患者知情同意，并簽知情同意書。

1.2試劑 鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結試劑盒、HSP47、Ⅰ型及Ⅲ型膠原鼠抗人單克隆抗體均購于北京中山生物試劑公司。

1.3方法 所有標本取材后即固定在10%甲醛溶液中，常規石蠟包埋備用。采用免疫組織化學法檢測HSP47以及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達：常規制備石蠟連續切片，按照免疫組織化學法試劑盒的說明書進行免疫組織化學染色，中性樹膠封片。每批標本均設陽性對照，用生理鹽水代替一抗設空白對照，成纖維細胞的細胞質中出現淡到棕褐色顆粒為陽性。按照盲法的原則對陽性結果進行半定量分析，隨機選取每張切片的5個陽性表達區視野(×200)計算其灰度值，以5個視野的平均灰度值作為該切片的灰度值，灰度值越低表示組織中抗原的含量越高。

2 結 果

2.1HSP47、Ⅰ型以及Ⅲ型膠原的表達 瘢痕疙瘩皮損組中成纖維細胞的細胞質中可見大量HSP47陽性顆粒的表達(圖1，見封三)，正常皮膚對照組中真皮層成纖維細胞的細胞質中少或不表達(圖2，見封三)，瘢痕疙瘩皮損組的灰度值顯著低于正常皮膚對照組(P<0.01)；瘢痕疙瘩皮損組中，Ⅰ型膠原纖維粗大、致密、條索、平行分布(圖3，見封三)，而Ⅲ型膠原纖細、稀疏，量少(圖4，見封三)，正常皮膚對照組中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達都較少或較弱，瘢痕疙瘩皮損組Ⅰ、Ⅲ型膠原的灰度值顯著低于正常皮膚對照組(P<0.05)(表1)。

表1 瘢痕疙瘩皮損組及正常皮膚對照組中HSP47、Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達情況

2.2HSP47與Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的相關性 在瘢痕疙瘩組中HSP47的灰度值與Ⅰ型及Ⅲ型膠原的灰度值呈顯著正相關(r=0.51，0.81，P<0.01)。

3 討 論

瘢痕疙瘩是一種膠原沉積性疾病，其發病與種族、遺傳、細胞因子以及相關凋亡基因有關，細胞外基質的產生與失衡是瘢痕疙瘩形成的重要原因之一。HSP47參與了膠原的合成，是膠原成熟的必要條件[3]。目前研究發現，HSP47在多種纖維化疾病中的表達都是升高的[4]。在肝纖維化者的肝組織中，HSP47的表達顯著升高，且伴隨膠原沉積量的增加而升高[5]。在腎小球腎炎大鼠模型中用HSP47干擾小RNA干擾HSP47的表達可以有效減少膠原的合成，減輕腎纖維化程度[2]。

本研究結果顯示，HSP47、Ⅰ及Ⅲ型膠原在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達量顯著高于正常皮膚對照組(t=9.5、8.5、3.1，P<0.05)，在瘢痕疙瘩組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的比例失衡可能與HSP47基因優先作用Ⅰ型膠原有關，從而使Ⅰ型膠原的合成多于Ⅲ型膠原。由此推斷，在瘢痕疙瘩形成的過程中，由于某種應激因素(如外傷等)刺激致使HSP47基因激活，導致HSP47基因高水平轉錄以及HSP47蛋白的合成增加，致使膠原的分泌量顯著高于正常水平，膠原過度沉積最終形成瘢痕疙瘩。本研究發現，HSP47基因的表達與Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達呈正相關(r=0.49，0.79，P<0.01)，說明HSP47基因的過度表達可明顯加重瘢痕疙瘩的纖維化程度，這與HSP47在腎纖維化中的作用相一致[4]。金培生等[6]利用HSP47、干擾小RNA重組質粒對瘢痕疙瘩裸鼠模型進行轉染，選擇性沉默HSP47基因的表達，HSP47、信使RNA及Ⅰ型膠原信使RNA的表達明顯下降，瘢痕疙瘩的膠原含量也明顯下降，瘢痕疙瘩的體積縮小，也說明了HSP47在瘢痕疙瘩形成的過程中發揮了重要作用。綜上所述，HSP47基因的表達促進Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成，抑制HSP47基因的表達可以有效阻抑Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成，其為瘢痕疙瘩的治療提供了新的線索。

[1] 郭雷洋.瘢痕疙瘩發病機制的研究進展[J].中國美容醫學,2012,21(11):1674-1677.

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[3] Hendershot LM,Bulleid NJ.Protein-specific chaperones:The role of HSP47 begins to gel[J].Curr Biol,2000,10(24):912-915.

[4] 張軍,官浩,胡大海.熱休克蛋白47與纖維化相關疾病研究進展[J].中華燒傷雜志,2009,25(1):75-78.

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[6] 金培生,陳俊杰,岑瑛,等.熱休克蛋白47重組質粒對病理性瘢痕的體內干預研究[J].中華整形外科雜志,2009,25(5):377-380.