普拉格雷含量及有關物質的測定

劉 娥

(荊楚理工學院化工與藥學院，湖北 荊門 448000)

普拉格雷，為氯吡格雷類似物，由日本Sankyo公司和美國Eli Lilly公司共同開發，用于治療動脈粥樣硬化血栓和急性冠狀動脈綜合征[1]，是一種新的前藥類抗血小板藥物[2],2009年3月其薄膜包衣片首次在英國上市[3]。臨床研究發現，普拉格雷較氯吡格雷有更好的抗凝血效果。另外，普拉格雷起效快，療效好，作用時間持久，不良反應少，也可以很好地預防心血管疾病。目前對于普拉格雷的合成報道較多，但該原料藥含量及有關物質分析尚未見報道。為了更好地使用普拉格雷，保證臨床用藥的質量安全,作者采用高效液相色譜法(HPLC)測定普拉格雷及有關物質含量。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

普拉格雷標準品，中國藥品生物制品檢定所；普拉格雷原料藥樣品,自制;乙腈，色譜純；水為超純水；其它試劑均為分析純。

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(DAD檢測器)、TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計、Milli-Q型超純水機，美國Millipore公司；CP-224S型電子分析天平，德國賽多利斯。

1.2 方法[4]

1.2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長219 nm，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)，流速1.0 mL·min-1，進樣量 10 μL。

1.2.2 標準品溶液的配制

精密稱取普拉格雷標準品，配制成1 mg·mL-1的溶液，作為標準品儲備液。精密量取標準品儲備液1 mL，加流動相稀釋至10 mL,得到標準品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

精密稱取普拉格雷原料藥，配制成1 mg·mL-1的溶液，作為供試品儲備液。精密量取供試品儲備液1 mL，加流動相稀釋至10 mL,得到供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

稱取普拉格雷標準品適量,加乙腈溶解并稀釋配制成濃度為10 μg·mL-1的溶液,經紫外分光光度計掃描,發現普拉格雷在219 nm處有最大吸收。故選取檢測波長為219 nm。

2.2 流動相的選擇

選取甲醇-乙腈、甲醇-三乙胺及甲醇-磷酸鹽緩沖溶液、乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(不同比例)為流動相進樣檢測。結果發現，采用乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)，分離效果較好。故選取流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)。

2.3 分離專屬性

取5 mL普拉格雷標準品儲備液分別加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液、1 mol·L-1鹽酸溶液、30%過氧化氫溶液各2 mL和100 ℃水浴加熱1 h。中和后加流動相至10 mL,分別進樣10 μL,考察降解物的分離性能，結果見圖1。

由圖1可知，經酸、堿、高溫、氧化破壞后的降解物，均能與主峰普拉格雷較好分離，表明方法的專屬性好。

2.4 系統適應性

分別量取空白溶液、標準品溶液、供試品溶液，按1.2.1色譜條件進樣測定。結果表明，主峰保留時間6.6 min,拖尾因子為1.02， 與相鄰雜質峰的分離度均大于1.5,理論塔板數按普拉格雷峰計算不低于3 000。

2.5 檢測限

取普拉格雷標準品,精密稱定,加流動相溶解并稀釋制成一系列濃度溶液,取10 μL進樣，當主成分峰高為最大噪音峰高的3倍時,進樣量即為檢測限。測定檢測限為0.03 μg·mL-1。

2.6 線性關系考察

精密量取普拉格雷標準品儲備液適量，加流動相稀釋制成濃度(μg·mL-1)分別為3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5系列溶液。各取10 μL進樣測定，以峰面積(y)為縱坐標、進樣濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，擬合得回歸方程y=1453.4x+3.122,R=0.9999，在0.5～3.0 μg·mL-1范圍內，線性關系良好。

2.7 精密度

取普拉格雷濃度為1.0 μg·mL-1的供試品溶液，按1.2.1色譜條件進樣，連續進樣6次，測定峰面積，主成分峰面積的 RSD為0.8%(n=6) ，相關物質峰面積的RSD為1.2%(n=6)。

2.8 穩定性

取普拉格雷濃度為1.0 μg·mL-1的供試品溶液，按1.2.1色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進樣，測定峰面積，供試品溶液主成分峰面積的 RSD為0.3%(n=6)，相關物質峰面積的 RSD 為 0.9%(n=6)。表明供試品溶液在12 h內檢測穩定性良好。

2.9 重復性

取同一批供試品溶液，按1.2.1色譜條件進樣測定，平行測定6次，RSD為0.65%(n=6)。

2.10 加樣回收率

精密量取普拉格雷供試品溶液9份，每份 10 mL，按其濃度的 80%、100%、120%分別加入普拉格雷對照品各3份，按1.2.1色譜條件進樣。普拉格雷的加樣回收率見表 1。

表1回收率結果(n=9)

Tab.1Result of recovery rate(n=9)

2.11 樣品測定

按1.2.1色譜條件測定3批次供試品，按外標法以峰面積計算普拉格雷含量分別為99.5%、99.8%、99.7%。

2.12 有關物質的測定

按1.2.1色譜條件進樣標準品溶液，調節儀器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%左右，再量取標準品溶液和供試品溶液，參照有關物質測定方法[5]分別測定，3批次有關物質含量分別為0.265%、0.253%、0.250%。

3 結論

建立了HPLC法測定普拉格雷的含量和有關物質。色譜條件如下：色譜柱為C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長219 nm，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)，流速為1.0 mL·min-1，進樣量10 μL。此法操作簡便、快速、靈敏、準確，樣品處理簡便易行，可用于普拉格雷原料藥含量測定和有關物質的檢測。

[1] 孫志國，侯建，鄒強,等.普拉格雷的合成[J].中國醫藥工業雜志,2009,40(4):244-246.

[2] 段妍琴，陳國華，李素義.合成鹽酸普拉格雷的工藝改進[J].合成化學，2012,20(1)：125-127.

[3] 程興棟,童玲,楊玉雷,等.普拉格雷的合成工藝研究[J].中國新藥雜志，2010,19(15)：1314-1316.

[4] 劉雅茹，韓秋月，梁晨.HPLC法測定原料藥中硫酸氫氯吡格雷及有關物質含量[J].化學與生物工程，2010,27(8)：92-94.

[5] 米亞嫻,吳燕,李華龍,等.反相高效液相色譜法測定巴洛沙星片的含量及有關物質[J].天津藥學，2008,20(5)：10-12.