脊柱側(cè)凸患者髂骨松質(zhì)骨總RNA提取方法

趙煥英，殷 紅，隋雷鳴，趙君朋

(首都醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)實驗與測試中心，北京 100069)

脊柱側(cè)凸分先天性和后天性兩種，后天性中尤其以青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)發(fā)病率最高，占全部脊柱側(cè)凸患者中發(fā)生率的74.7%[1]。目前研究認為該病受生長發(fā)育、激素分泌、重力等多因素影響，但迄今為止發(fā)病機制仍不明確[2-3]。近年來更多的科研工作致力于AIS發(fā)生、發(fā)展的確切的分子機制研究，這就要求能從臨床組織標(biāo)本中提取出高質(zhì)量總RNA(核糖核酸)，從而可以開展RNA為靶標(biāo)進行的分子生物學(xué)分析。由于人體的松質(zhì)骨屬于成熟的結(jié)締組織，主要由堅韌的基質(zhì)——膠原、蛋白多糖組成，且松質(zhì)骨內(nèi)含有大量造血細胞及脂肪等，富含降解核酸的各種酶分子。因此很難從細胞量少、難于裂解的致密結(jié)締組織中提取出完整和純凈的總RNA，限制了對此類組織進行直接研究。所以大多數(shù)研究者采用成骨細胞體外分離、培養(yǎng)技術(shù)，然后從培養(yǎng)細胞中再提取總RNA，或者經(jīng)過脫鈣及切片處理，進行下游不同因子分子水平的實驗[4-7]。但這種經(jīng)過體外培養(yǎng)的骨細胞核酸水平不能真實反映臨床機體的基因水平。因此從臨床骨標(biāo)本中提取高質(zhì)量的總RNA技術(shù)成為疾病分子水平研究的關(guān)鍵步驟。

本文從臨床手術(shù)中取下的少許松質(zhì)骨標(biāo)本(髂骨嵴前1/3的下緣，及脊柱側(cè)凸病變部位的棘突)中提取總RNA，并對提取方法進行優(yōu)化，以提高RNA品質(zhì)。

1 實驗試劑、樣品及儀器

試劑：組織標(biāo)本保存液RNAlater、RNeasy?Lipid Tissue kits(Qiagen公司)；Trizol(sigma公司)；RNase 抑制劑、DNaseⅠ、DNase 滅活劑 (Ambion公司)；FastQuant RT Kit(with gDNase) cDNA第1鏈合成試劑盒 (Tiangen公司)；Power SYBR Green master mix(ABI公司)；苯酚、氯仿、異戊醇等其他生化試劑都為分析純。

樣品：即組織標(biāo)本，取自北京朝陽醫(yī)院骨科需手術(shù)治療的病人體內(nèi)。所有受試者的標(biāo)本均需取髂松質(zhì)骨、行植骨融合手術(shù)中的樣品，在患者知情同意和不影響手術(shù)療效的情況下取少許松質(zhì)骨標(biāo)本，并且在手術(shù)病變部位取棘突。

儀器：低溫高速離心機 (Heraeus 公司)；Gel-Del紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；Tissue LyserⅡSystem(Qiagen公司)；Nano2000紫外分光光度儀(Fisher公司)；電泳儀(Bio-Rad)；IQ5Real-time PCR儀(BIO-rad)。

2 實驗

2.1 實驗用品處理

實驗所用的金屬器械都經(jīng)180℃干烤6h以上，滅活RNA酶。所用的塑料離心管的槍頭都經(jīng)0.1%DEPC浸泡并高壓處理。所用實驗溶液都經(jīng)0.1%DEPC水配置，如磷酸緩沖液(PBS)、高鹽溶液等。

2.2 樣品處理

用無核酸酶的PBS反復(fù)沖洗松質(zhì)骨標(biāo)本髂前上棘(記為A)和棘突(記為B)，直到發(fā)白。樣品浸泡在RNA later溶液中存放。實驗開始時，取出樣品，放入研缽內(nèi)，添加液氮冷凍標(biāo)本，并用咬骨鉗先把組織咬碎成骨粒，在液氮保護下迅速把骨粒轉(zhuǎn)移到2mL離心管內(nèi),內(nèi)放置一個直徑5mm不銹鋼珠，然后放置在Tissue LyserⅡsystem儀器上以20Hz快速震蕩3min,使組織快速研磨成粉末。

2.3 總RNA提取方法

將上述兩種研磨成粉末的骨組織樣品，分別在分析天平上等量稱取并分成3份。分別按下述的3種方法提取總RNA。

(1) 按Trizol試劑說明書提取。

(2) 按RNeasy?Lipid Tissue kits 試劑盒說明書提取。

(3) 改良十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyltrimethy ammonium bromide，簡稱CTAB法)提取。抽提緩沖液包括：2% CTAB、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1.4mol/L NaC1、20mmol/L EDTA (pH8.0)，2%PVP、2%β- 巰基乙醇，其中β- 巰基乙醇使用前加入。按100mg樣品加入2mL的CTAB 裂解液，渦旋劇震30s，使裂解液與組織充分混勻，室溫放置10min；4℃條件下12000×g離心15min；吸取上清于新離心管中，加入等體積的苯酚，上下顛倒數(shù)次，并加入1/4上清體積的氯仿，再次上下顛倒混勻數(shù)次，室溫孵育5min；12000×g、4℃下離心10min； 小心吸取2/3上清液于一新離心管中，加入1/4體積異丙醇和1/4體積高鹽溶液(0.8mol/L檸檬酸鈉和1.2mol/L NaCl)混合離心；于-20℃下放置1h或過夜；4℃下12000×g離心15min；棄上清，70%乙醇清洗沉淀兩次，于超凈工作臺晾干，加適量DEPC 水完全溶解。

2.4 RNA 純度、完整性及濃度測定

3組RNA樣品分別取1μL放置于Nano2000儀器上測定核酸光密的吸光度值(A260)、蛋白質(zhì)的吸光度值(A280)、背景雜質(zhì)的吸光度值(A320)和A260/A280值。檢測前以無RNase水為空白液調(diào)零，樣品重復(fù)檢測3次，取其平均值。用1.0%非變性瓊脂糖凝膠，給電泳儀加電壓120V、電泳30min后放在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、分析檢測結(jié)果。

2.5 RT-PCR檢測

2.5.1cDNA合成

提取的總RNA按照第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit(with gDNase) (Tiangen) 操作說明，先加入gDNA 和相應(yīng)緩沖液進行42℃下5min的基因組DNA的除去反應(yīng)，然后加入反轉(zhuǎn)錄酶和相應(yīng)緩沖液在合適溫度下進行cDNA第一鏈合成反應(yīng)。

2.5.2引物設(shè)計

根據(jù)Genbank 數(shù)據(jù)庫中人基因組序列號：NM_001101，設(shè)計人內(nèi)參基因β-actin引物為Forward：5’- ACCTTCTACAATGAGCTGCG -3’ Reverse ：5’- CCTGGATAGCAACGTACATGG -3’ 擴增148bp的目的片段。根據(jù)NM_025237.2，設(shè)計人SOST基因引物 Forward：5’- Forward CTGTGCTACTGGAAGGTGG -3’, Reverse ：5’- TCATTCTTGAACGCCTGCC -3’.擴增長度為137bp的片段。設(shè)計的2個基因的引物都跨內(nèi)含子。

2.5.3Real-time PCR 反應(yīng)

根據(jù)Power SYBR Green master mix說明書配置熒光Real-time PCR反應(yīng)體系20μL：SYBR10μL，上游引物1μL(10μmol/L)，下游引物1μL(10μmol/L)，模板1μL,用蒸餾水補足到20μL。反應(yīng)條件：95℃、10min,95℃、15s,60℃、1min ,40個循環(huán)；反應(yīng)完后進行熔解曲線分析。

2.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS11.5軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 總RNA純度檢測

兩種標(biāo)本分別用3種方法提取總RNA后，在Nano2000紫外分光光度儀上進行測定。分別在260、280、230nm處讀取吸光度值，分別記為A260、A280和A230。260、280、230nm分別是核酸、蛋白質(zhì)和碳水化合物的最高吸收峰的吸收波長。A260/A280和A260/A230是核酸純度的指示值。從表1中可以看出，A260/A280的比值在1.9～2.1之間，符合純凈RNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；但3組的A260/A230的比值差別明顯，純RNA的A260/A230值應(yīng)該在大于或接近2，只有改良CTAB方法比值符合純RNA要求。若A260/A230值小于2.0，表明樣品被碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染，樣品仍需要進一步提純。

表1 紫外分光光度計測定RNA質(zhì)量和質(zhì)量濃度

3.2 總RNA完整性檢測

將3種方法提取的RNA分別進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描28 S 和18 S條帶，計算吸光度比值，確定RNA 的完整性和純度。圖1中泳道1和2是Trizol方法提取的，整個泳道布滿彌散條帶，上方有明顯的基因組DNA污染條帶；泳道3和4是用RNeasy試劑盒提取的，只能獲得28 S和18 S兩條帶，盡管試劑盒提取過程帶有DNase處理，條帶上仍有殘留彌散帶，說明是多糖類分子殘存；泳道5和6條帶是用改良的CTAB 方法提取的，具有理想的RNA 3條帶，且泳道干凈。

圖1 總RNA電泳圖

3.3 熒光Real-time PCR檢測反轉(zhuǎn)錄和擴增效率

用Real-time PCR檢測3組6個樣品的內(nèi)參基因β-aticn和目的基因SOST表達情況，每個樣品每個基因3孔重復(fù)。結(jié)果表明，每個樣品的β-actin和SOST的熔解曲線都是單一峰形，如圖2和圖3所示。以不同方式提取的總RNA，取相同量進行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物PCR結(jié)果顯示:β-actin的Ct(循環(huán)圈數(shù))值不同，Trizol組的β-actin Ct值大于RNeasy組的Ct值>CTAB組的Ct值。每個樣品以Trizol組為對照，目標(biāo)基因SOST用2-△△Ct法計算相對表達量F值，結(jié)果見表2。

圖2 β-actin 熔解曲線圖

圖3 SOST 熔解曲線圖

樣品方法β-actin(Ct)BMP(Ct)FACTAB17.58±0.0427.78±0.342.027RNeasy21.18±0.1731.65±0.181.682Trizol22.91±0.2234.13±0.111BCTAB18.92±0.2128.35±0.273.249RNeasy21.87±0.0831.51±0.152.809Trizol24.86±0.1435.99±0.311

4 討論

高質(zhì)量的RNA決定了基因表達結(jié)果的準(zhǔn)確性及后續(xù)分子生物學(xué)實驗的展開。因此建立高效快速提取骨組織中RNA 具有重要的應(yīng)用價值。

從圖1和表1中可得出，用Trizol方法提取，不但基因組DNA很難分離出去，且含有糖蛋白成分，導(dǎo)致獲得的RNA濃度最大，但純度也最差。用RNeasy lipid kits方法提取，主要以苯酚/胍的裂解方法及RNeasy硅膠膜純化方式相結(jié)合，能優(yōu)化DNase的處理,可以去除基因組DNA污染，但RNeasy技術(shù)僅適于提取大于200 nt的RNA，因此RNA產(chǎn)物不包括5S rRNA、tRNA或其他小分子量RNA，這些小分子RNA約占細胞內(nèi)總RNA的15%～20%。電泳圖(見圖1)中無5S rRNA條帶, 完整性差，從電泳帶及A260/A230比值都證明了仍然有多糖分子殘留。CTAB主要用于植物總RNA提取[8-9]，CTAB是一種強變性劑，能溶解細胞膜和核膜，使核蛋白解聚變性，從而使RNA得以游離出來。本實驗改良了傳統(tǒng)CTAB方法，PVP能有效去除多糖和脂類物質(zhì)，β- 巰基乙醇和EDTA滅火酶類物質(zhì)，高氯化鈉緩沖液可沉降去除多糖，酚和氯仿抽提去除蛋白類及部分糖蛋白，后用異丙醇沉淀RNA同時加入高鹽溶液，使黏蛋白即蛋白多糖類物質(zhì)留在上清中，不與RNA共沉淀，再次降低蛋白多糖的污染[10]。從圖1和表1可知，該法提取的RNA質(zhì)量高，能滿足后續(xù)實驗的要求。

評價RNA質(zhì)量的2個關(guān)鍵指標(biāo)是完整性和純凈度[11-12]。多糖等物質(zhì)的殘留會影響RNA的反轉(zhuǎn)錄效率。熒光Real-time PCR 結(jié)果顯示，2個樣品的β-actin Ct 值：Trizol的β-actin Ct值大于RNeasy的β-actin Ct值、大于CTAB的β-actin Ct值，在起始的RNA含量相同時，β-actin的Ct值不同，說明RNA的反轉(zhuǎn)率不同，Ct值越高反轉(zhuǎn)率越低。該結(jié)果說明，樣品的CTAB方法提取RNA反轉(zhuǎn)率最高，最低是Trizol法，也說明Trizol法提取總RNA受糖蛋白污染，不僅造成乙醇沉淀后的RNA難以溶解，且也抑制了RNA的反轉(zhuǎn)率。以Trizol法為對照，用2-△△Ct法計算目的基因SOST的不同提取方法的相對表達量，2個樣品都是CTAB法的F值最大，其次是RNeasy法。這樣也證實了用RNeasy硅膠膜純化方式雖然比Trizol法提高了純度，但最后用柱形硅膠膜洗脫方式得到的RNA量會減少，增大洗脫液濃度則必然也降低了RNA濃度，且不能完全去除多糖成分污染，影響反轉(zhuǎn)錄和定量效率。另外會缺失5S rRNA，若要研究骨的miRNA及小于200 nt的RNA不能用這種方式獲取總RNA。

5 結(jié)束語

本文改良的提取植物總RNA的CTAB技術(shù)，能夠快速提取人體骨組織的總RNA。由于RNA 是從成熟的骨組織中提取, 所以也更能客觀、整體地反映骨組織在體內(nèi)基因表達情況[ 7], 適用于骨代謝研究及其他后續(xù)實驗。

[1] 邱勇，朱麗華，宋知非，等.脊柱側(cè)凸的臨床病因?qū)W分類研究[J].中華骨科雜志，2000，20(5)：265-268.

[2] Burner R G. Aetiology of idiopathic scoliosis：current concepts[J]. Pediatr Rehabil, 2003,6(3/4):137-170.

[3] Heidari B，F(xiàn)itzpatrick D，Synnott K，et a1.Modelling of annulus fibrosus imbalance as an aetiological factor in adolescent idiopathic scoliosis[J]. Clin Biomeh，2004，19(3)：217-224.

[4] 孫超,邱勇,殷剛,等. M-CS F在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者成骨細胞中的表達及意義[J].中國骨與關(guān)節(jié)外科,2009,2(6):481-487.

[5] Spencer G J, Utting J C, Etheridge S L,et al. Wnt signalling in osteoblasts regulates expression of the receptor activator of NFkappaB ligand and inhibits osteoclastogenesis in vitro[J]. J Cell Sci，2006 119(7):1283-1296.

[6] 殷剛，邱勇，黃愛兵,等.轉(zhuǎn)錄因子Runx2在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者成骨細胞中的表達及其意義[J]. 中華外科雜志，2009，47(19)：1495-1498.

[7] Kuliwaba J S, Fazzalari N L, Findlay D M. Stability of RNA isolated from human trabecular bone at post- mortem and surgery[J]. Biochim Biophys Acta,2005(1):1-11.

[8] 劉洋,何心堯,馬紅波. 用CTAB-PVP法提取棉花各組織總RNA的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006 ,11(1):53- 56.

[9] 史成穎,宛曉春,江昌俊.提取高質(zhì)量茶樹總RNA的方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007,34(3):360-363.

[10] Nemeth G G, Heydemann A, Bolander M E. Iso lation and analysis of ribonucleic acids from skeletal tissues[J]. Anal Biochem,1989,183(2):301-304.

[11] Imbeaud S, Graudens E, Graudens V,et al. Towards standardization RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces[J].Nucleic Acids Res,2005,33(e56):1-12

[12] Fleige S , Pfaffl M W. RNA integrity and the effect on the real-time PCR performance[J]. Mol Aspects Med,2006,27:126-139.