脊柱側凸患者髂骨松質骨總RNA提取方法

趙煥英，殷 紅，隋雷鳴，趙君朋

(首都醫科大學 醫學實驗與測試中心，北京 100069)

脊柱側凸分先天性和后天性兩種，后天性中尤其以青少年特發性脊柱側凸(AIS)發病率最高，占全部脊柱側凸患者中發生率的74.7%[1]。目前研究認為該病受生長發育、激素分泌、重力等多因素影響，但迄今為止發病機制仍不明確[2-3]。近年來更多的科研工作致力于AIS發生、發展的確切的分子機制研究，這就要求能從臨床組織標本中提取出高質量總RNA(核糖核酸)，從而可以開展RNA為靶標進行的分子生物學分析。由于人體的松質骨屬于成熟的結締組織，主要由堅韌的基質——膠原、蛋白多糖組成，且松質骨內含有大量造血細胞及脂肪等，富含降解核酸的各種酶分子。因此很難從細胞量少、難于裂解的致密結締組織中提取出完整和純凈的總RNA，限制了對此類組織進行直接研究。所以大多數研究者采用成骨細胞體外分離、培養技術，然后從培養細胞中再提取總RNA，或者經過脫鈣及切片處理，進行下游不同因子分子水平的實驗[4-7]。但這種經過體外培養的骨細胞核酸水平不能真實反映臨床機體的基因水平。因此從臨床骨標本中提取高質量的總RNA技術成為疾病分子水平研究的關鍵步驟。

本文從臨床手術中取下的少許松質骨標本(髂骨嵴前1/3的下緣，及脊柱側凸病變部位的棘突)中提取總RNA，并對提取方法進行優化，以提高RNA品質。

1 實驗試劑、樣品及儀器

試劑：組織標本保存液RNAlater、RNeasy?Lipid Tissue kits(Qiagen公司)；Trizol(sigma公司)；RNase 抑制劑、DNaseⅠ、DNase 滅活劑 (Ambion公司)；FastQuant RT Kit(with gDNase) cDNA第1鏈合成試劑盒 (Tiangen公司)；Power SYBR Green master mix(ABI公司)；苯酚、氯仿、異戊醇等其他生化試劑都為分析純。

樣品：即組織標本，取自北京朝陽醫院骨科需手術治療的病人體內。所有受試者的標本均需取髂松質骨、行植骨融合手術中的樣品，在患者知情同意和不影響手術療效的情況下取少許松質骨標本，并且在手術病變部位取棘突。

儀器：低溫高速離心機 (Heraeus 公司)；Gel-Del紫外凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司)；Tissue LyserⅡSystem(Qiagen公司)；Nano2000紫外分光光度儀(Fisher公司)；電泳儀(Bio-Rad)；IQ5Real-time PCR儀(BIO-rad)。

2 實驗

2.1 實驗用品處理

實驗所用的金屬器械都經180℃干烤6h以上，滅活RNA酶。所用的塑料離心管的槍頭都經0.1%DEPC浸泡并高壓處理。所用實驗溶液都經0.1%DEPC水配置，如磷酸緩沖液(PBS)、高鹽溶液等。

2.2 樣品處理

用無核酸酶的PBS反復沖洗松質骨標本髂前上棘(記為A)和棘突(記為B)，直到發白。樣品浸泡在RNA later溶液中存放。實驗開始時，取出樣品，放入研缽內，添加液氮冷凍標本，并用咬骨鉗先把組織咬碎成骨粒，在液氮保護下迅速把骨粒轉移到2mL離心管內,內放置一個直徑5mm不銹鋼珠，然后放置在Tissue LyserⅡsystem儀器上以20Hz快速震蕩3min,使組織快速研磨成粉末。

2.3 總RNA提取方法

將上述兩種研磨成粉末的骨組織樣品，分別在分析天平上等量稱取并分成3份。分別按下述的3種方法提取總RNA。

(1) 按Trizol試劑說明書提取。

(2) 按RNeasy?Lipid Tissue kits 試劑盒說明書提取。

(3) 改良十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyltrimethy ammonium bromide，簡稱CTAB法)提取。抽提緩沖液包括：2% CTAB、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1.4mol/L NaC1、20mmol/L EDTA (pH8.0)，2%PVP、2%β- 巰基乙醇，其中β- 巰基乙醇使用前加入。按100mg樣品加入2mL的CTAB 裂解液，渦旋劇震30s，使裂解液與組織充分混勻，室溫放置10min；4℃條件下12000×g離心15min；吸取上清于新離心管中，加入等體積的苯酚，上下顛倒數次，并加入1/4上清體積的氯仿，再次上下顛倒混勻數次，室溫孵育5min；12000×g、4℃下離心10min； 小心吸取2/3上清液于一新離心管中，加入1/4體積異丙醇和1/4體積高鹽溶液(0.8mol/L檸檬酸鈉和1.2mol/L NaCl)混合離心；于-20℃下放置1h或過夜；4℃下12000×g離心15min；棄上清，70%乙醇清洗沉淀兩次，于超凈工作臺晾干，加適量DEPC 水完全溶解。

2.4 RNA 純度、完整性及濃度測定

3組RNA樣品分別取1μL放置于Nano2000儀器上測定核酸光密的吸光度值(A260)、蛋白質的吸光度值(A280)、背景雜質的吸光度值(A320)和A260/A280值。檢測前以無RNase水為空白液調零，樣品重復檢測3次，取其平均值。用1.0%非變性瓊脂糖凝膠，給電泳儀加電壓120V、電泳30min后放在凝膠成像分析系統中觀察、分析檢測結果。

2.5 RT-PCR檢測

2.5.1cDNA合成

提取的總RNA按照第一鏈反轉錄試劑盒FastQuant RT Kit(with gDNase) (Tiangen) 操作說明，先加入gDNA 和相應緩沖液進行42℃下5min的基因組DNA的除去反應，然后加入反轉錄酶和相應緩沖液在合適溫度下進行cDNA第一鏈合成反應。

2.5.2引物設計

根據Genbank 數據庫中人基因組序列號：NM_001101，設計人內參基因β-actin引物為Forward：5’- ACCTTCTACAATGAGCTGCG -3’ Reverse ：5’- CCTGGATAGCAACGTACATGG -3’ 擴增148bp的目的片段。根據NM_025237.2，設計人SOST基因引物 Forward：5’- Forward CTGTGCTACTGGAAGGTGG -3’, Reverse ：5’- TCATTCTTGAACGCCTGCC -3’.擴增長度為137bp的片段。設計的2個基因的引物都跨內含子。

2.5.3Real-time PCR 反應

根據Power SYBR Green master mix說明書配置熒光Real-time PCR反應體系20μL：SYBR10μL，上游引物1μL(10μmol/L)，下游引物1μL(10μmol/L)，模板1μL,用蒸餾水補足到20μL。反應條件：95℃、10min,95℃、15s,60℃、1min ,40個循環；反應完后進行熔解曲線分析。

2.6 統計分析

采用SPSS11.5軟件，對數據進行單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 總RNA純度檢測

兩種標本分別用3種方法提取總RNA后，在Nano2000紫外分光光度儀上進行測定。分別在260、280、230nm處讀取吸光度值，分別記為A260、A280和A230。260、280、230nm分別是核酸、蛋白質和碳水化合物的最高吸收峰的吸收波長。A260/A280和A260/A230是核酸純度的指示值。從表1中可以看出，A260/A280的比值在1.9～2.1之間，符合純凈RNA質量標準；但3組的A260/A230的比值差別明顯，純RNA的A260/A230值應該在大于或接近2，只有改良CTAB方法比值符合純RNA要求。若A260/A230值小于2.0，表明樣品被碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染，樣品仍需要進一步提純。

表1 紫外分光光度計測定RNA質量和質量濃度

3.2 總RNA完整性檢測

將3種方法提取的RNA分別進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統掃描28 S 和18 S條帶，計算吸光度比值，確定RNA 的完整性和純度。圖1中泳道1和2是Trizol方法提取的，整個泳道布滿彌散條帶，上方有明顯的基因組DNA污染條帶；泳道3和4是用RNeasy試劑盒提取的，只能獲得28 S和18 S兩條帶，盡管試劑盒提取過程帶有DNase處理，條帶上仍有殘留彌散帶，說明是多糖類分子殘存；泳道5和6條帶是用改良的CTAB 方法提取的，具有理想的RNA 3條帶，且泳道干凈。

圖1 總RNA電泳圖

3.3 熒光Real-time PCR檢測反轉錄和擴增效率

用Real-time PCR檢測3組6個樣品的內參基因β-aticn和目的基因SOST表達情況，每個樣品每個基因3孔重復。結果表明，每個樣品的β-actin和SOST的熔解曲線都是單一峰形，如圖2和圖3所示。以不同方式提取的總RNA，取相同量進行反轉錄，產物PCR結果顯示:β-actin的Ct(循環圈數)值不同，Trizol組的β-actin Ct值大于RNeasy組的Ct值>CTAB組的Ct值。每個樣品以Trizol組為對照，目標基因SOST用2-△△Ct法計算相對表達量F值，結果見表2。

圖2 β-actin 熔解曲線圖

圖3 SOST 熔解曲線圖

樣品方法β-actin(Ct)BMP(Ct)FACTAB17.58±0.0427.78±0.342.027RNeasy21.18±0.1731.65±0.181.682Trizol22.91±0.2234.13±0.111BCTAB18.92±0.2128.35±0.273.249RNeasy21.87±0.0831.51±0.152.809Trizol24.86±0.1435.99±0.311

4 討論

高質量的RNA決定了基因表達結果的準確性及后續分子生物學實驗的展開。因此建立高效快速提取骨組織中RNA 具有重要的應用價值。

從圖1和表1中可得出，用Trizol方法提取，不但基因組DNA很難分離出去，且含有糖蛋白成分，導致獲得的RNA濃度最大，但純度也最差。用RNeasy lipid kits方法提取，主要以苯酚/胍的裂解方法及RNeasy硅膠膜純化方式相結合，能優化DNase的處理,可以去除基因組DNA污染，但RNeasy技術僅適于提取大于200 nt的RNA，因此RNA產物不包括5S rRNA、tRNA或其他小分子量RNA，這些小分子RNA約占細胞內總RNA的15%～20%。電泳圖(見圖1)中無5S rRNA條帶, 完整性差，從電泳帶及A260/A230比值都證明了仍然有多糖分子殘留。CTAB主要用于植物總RNA提取[8-9]，CTAB是一種強變性劑，能溶解細胞膜和核膜，使核蛋白解聚變性，從而使RNA得以游離出來。本實驗改良了傳統CTAB方法，PVP能有效去除多糖和脂類物質，β- 巰基乙醇和EDTA滅火酶類物質，高氯化鈉緩沖液可沉降去除多糖，酚和氯仿抽提去除蛋白類及部分糖蛋白，后用異丙醇沉淀RNA同時加入高鹽溶液，使黏蛋白即蛋白多糖類物質留在上清中，不與RNA共沉淀，再次降低蛋白多糖的污染[10]。從圖1和表1可知，該法提取的RNA質量高，能滿足后續實驗的要求。

評價RNA質量的2個關鍵指標是完整性和純凈度[11-12]。多糖等物質的殘留會影響RNA的反轉錄效率。熒光Real-time PCR 結果顯示，2個樣品的β-actin Ct 值：Trizol的β-actin Ct值大于RNeasy的β-actin Ct值、大于CTAB的β-actin Ct值，在起始的RNA含量相同時，β-actin的Ct值不同，說明RNA的反轉率不同，Ct值越高反轉率越低。該結果說明，樣品的CTAB方法提取RNA反轉率最高，最低是Trizol法，也說明Trizol法提取總RNA受糖蛋白污染，不僅造成乙醇沉淀后的RNA難以溶解，且也抑制了RNA的反轉率。以Trizol法為對照，用2-△△Ct法計算目的基因SOST的不同提取方法的相對表達量，2個樣品都是CTAB法的F值最大，其次是RNeasy法。這樣也證實了用RNeasy硅膠膜純化方式雖然比Trizol法提高了純度，但最后用柱形硅膠膜洗脫方式得到的RNA量會減少，增大洗脫液濃度則必然也降低了RNA濃度，且不能完全去除多糖成分污染，影響反轉錄和定量效率。另外會缺失5S rRNA，若要研究骨的miRNA及小于200 nt的RNA不能用這種方式獲取總RNA。

5 結束語

本文改良的提取植物總RNA的CTAB技術，能夠快速提取人體骨組織的總RNA。由于RNA 是從成熟的骨組織中提取, 所以也更能客觀、整體地反映骨組織在體內基因表達情況[ 7], 適用于骨代謝研究及其他后續實驗。

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