牡荊素與DNA相互作用的機理研究

劉 煒，劉 紅

（海南師范大學化學與化工學院，海口571158）

DNA與藥物分子相互作用的研究有助于了解藥物的作用機理，并更有效地指導新藥設計，以DNA作為藥物作用靶是有效的新興的藥物篩選和新藥設計手段［1－3］.

牡荊素屬于黃酮苷類化合物，存在于山楂、牡荊、竹葉等植物中，主要用于治療心血管疾病，也是防癌抗腫瘤的天然藥物成分，具有較強的抗氧化、抗癌、抗病毒的藥理活性，生物活性測定中對人類癌細胞顯示了廣泛的細胞毒作用.本論文主要通過紫外吸收光譜法、熒光光譜法和黏度法研究牡荊素與DNA的相互作用，該研究將有助于揭示牡荊素的抗癌機理.

圖1 牡荊素結構式Fig.1 The structure of vitexin

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TU－1901紫外可見分光光度計（普析通用，北京），PHS－25型p H計（上海雷磁），日立F－4500熒光分光光度儀（日本）.

DNA貯備液：稱取0.1 g的鯡魚精DNA（Sigma公司）以二次蒸餾水定容于100 m L的容量瓶中，由在260 nm處的吸光度（ε＝6600 L·mol－1·cm－1）確定其濃度，冰箱中冷藏.

牡荊素（中檢所，純度≥99.8%）貯備液：稱取一定量的牡荊素，以乙醇定容至100 mL的容量瓶中配制成濃度為10－3mol／L，置于0至4℃下保存.

緩沖溶液：用鹽酸滴加到0.1 mol／L的Tris（三羥甲基氨基甲烷）中，在p H計上調成p H7.4的緩沖溶液.

1.2 實驗方法

在10 m L的比色管中依次加入1 m L p H7.4的緩沖溶液、小檗堿、DNA溶液，以及不同量的牡荊素工作溶液，定容、搖勻，進行熒光光譜的測定.熒光激發波長定為358 nm，熒光發射峰位為532 nm，狹縫寬均為5 nm.

在10 m L的比色管中依次加入1 m L p H7.4的緩沖溶液、牡荊素工作溶液和不同量的DNA溶液，定容、搖勻，以試劑空白為參比，進行紫外吸收光譜的測定.

2 結果與討論

2.1 牡荊素對DNA紫外吸收光譜的影響

圖2為牡荊素對DNA紫外吸收光譜的影響.

圖2 牡荊素對DNA紫外吸收光譜的影響Fig.2 The UV absorption spectra of DNA in the presence of vitexin

從圖2中可以看出，DNA在257 nm處有一最大紫外吸收峰，連續加入牡荊素后，其吸收度持續增強，表明牡荊素與DNA發生了反應.由于DNA在257 nm處的吸收峰來自于其堿基對，因此表明牡荊素與DNA的堿基對發生了結合.

2.2 DNA對牡荊素紫外吸收光譜的影響

圖3為DNA對牡荊素紫外吸收光譜的影響，由圖3可以看出，牡荊素在220 nm及274 nm處各有一紫外吸收峰，DNA的加入導致兩處吸收峰的吸光度明顯降低，同時紫外吸收峰明顯紅移（274 nm→279 nm）.由于藥物與DNA大致有3種結合模式：靜電式、嵌入式和溝槽式，其中靜電式結合不會發生藥物吸收峰的紅移或藍移；如果小分子與DNA是通過嵌入式鍵合，DNA的加入會引起藥物分子的紫外吸收峰發生紅移，溝槽式則發生藍移［4－6］.因此，可判斷葒草苷與DNA為嵌入式結合.

圖3 DNA對牡荊素紫外吸收光譜的影響Fig.3 The UV absorption spectra of vitexin in the presence of DNA

2.3 牡荊素對BR－DNA體系熒光光譜的影響

鹽酸小檗堿（BR）可作為熒光探針研究小分子化合物與DNA的相互作用，當藥物小分子插入到DNA雙螺旋中時，可與小檗堿發生競爭結合DNA的反應，將小檗堿從雙螺旋中擠出，從而熒光強度降低［4－5］.連續向小檗堿－DNA體系中加入不同量的牡荊素，實驗結果如圖4所示.小檗堿－DNA體系在532 nm處有一顯著熒光發射峰，隨著牡荊素的連續加入，其熒光強度持續下降，說明牡荊素對小檗堿－DNA體系發生了熒光猝滅作用.

圖4 牡荊素對小檗堿－DNA體系熒光發射光譜的影響Fig.4 The fluorescence emission spectra of BR－DNA in the presence of vitexin

2.4 熒光猝滅方式的判斷

由動態猝滅Stern－Volmer 方程：F0／F＝1＋Kqτ0c＝1＋Ksvc（1）［7］，根據牡荊素對BRDNA的猝滅光譜所得熒光強度計算得F0／F－1，按式（1）對c作線性回歸（圖5），求得在298 K時，牡荊素對BR－DNA的Stern－Volmer猝滅常數Ksv為5.785×103L／mol（相關系數為0.9647），則其雙分子速率常數Kq為5.785×1011L·mol－1·s－1，遠大于各猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，因此牡荊素對BR－DNA的熒光猝滅不是動態猝滅所引起，而是因為形成復合物所產生的靜態猝滅.實驗結果表明，牡荊素與DNA是以嵌入方式結合，導致小檗堿被擠出DNA雙螺旋，從而發生熒光猝滅.

圖5 牡荊素與BR－DNA反應的stern－volmer方程Fig.5 Stern－Volmer curves for the binding of vitexin to BR－DNA at 298 K

2.5 牡荊素與DNA的結合常數和結合位點數由靜態猝滅公式

由式（2）分別作出不同溫度下牡荊素－DNA體系的關系圖.結果如圖6，通過外推截距和斜率可求出25℃和40℃牡荊素與DNA之間的結合常數分別為1.156×105L·mol－1和1.885×104L·mol－1，結合位點數分別為1.336 3和1.061 5.

2.6 牡荊素與DNA結合反應的熱力學性質及作用力的影響

根據熱力學公式可以計算藥物小分子與生物大分子作用間的有關熱力學參數［10－11］：

根據熱力學參數可以簡單判斷其相互作用類型：ΔH＞0及ΔS＞0為疏水作用，ΔH＜0及ΔS＞0為靜電作用，ΔH＜0及ΔS＜0為氫鍵或者范德華作用［12－15］.

根據牡荊素與DNA的結合常數K1（298 K）＝1.156×105L·mol－1，K2（313 K）＝1.885×104L·mol－1，按式（3）～（5）可以求得二者結合過程的熱力學參數：

由此可初步判斷牡荊素與DNA主要是以氫鍵或者范德華作用力結合.

圖6 牡荊素與DNA反應的lg［（F 0－F）／F］～lg c關系圖Fig.6 The plot of lg［（F 0－F）／F］vs lg c of the reaction between vitexin and DNA

圖7 牡荊素對DNA相對黏度的影響Fig.7 The effect of vitexin on the relative viscosity

2.7 牡荊素與DNA反應的黏度研究

當藥物分子以嵌入的方式與DNA結合，DNA雙螺旋變長，粘度增加［12，16］.向固定濃度的DNA溶液中加入不同量的牡荊素，由實驗結果，按下式計算相對粘度：η＝（t－t0）／t0.式中t0為空白溶液流經毛細管所需時間，t為含不同量牡荊素的DNA溶液流經毛細管所需時間，以（η／η0）1／3對結合比率r（cvitexin／cDNA）作圖，η0為未加入牡荊素時DNA的粘度［12］，如圖7所示.隨著牡荊素濃度的增大，DNA相對粘度逐漸增大，由此可知牡荊素與DNA以嵌入方式結合，結果與熒光、紫外光譜結果相吻合.

3 結論

本文利用熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了牡荊素與DNA相互作用的機理，實驗結果表明，牡荊素與DNA主要通過氫鍵或者范德華作用力以嵌入模式結合，從而阻止了細胞中DNA的復制，這可能是牡荊素具有較強抗癌活性的原因之一.25℃和40℃兩個不同溫度下下牡荊素與DNA之間的結合常數分別為1.156×105和1.885×104L·mol－1，結合位點數分別為1.3363和1.0615.

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