毛細(xì)管GC法同時(shí)測(cè)定艾葉油中桉油精、樟腦和龍腦的含量

熊 瑩，吳鐵軍，滕 佳，孫 蕾，葛月賓＊，洪宗國(guó)

（1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢430074；2.國(guó)藥集團(tuán)致君制藥有限公司，廣東深圳518000；3.湖北四環(huán)制藥有限公司，武漢430056）

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉，具溫經(jīng)止血、散寒止痛、外用祛濕止癢之功效［1］.艾葉油為艾葉經(jīng)水蒸氣蒸餾提取出來的揮發(fā)油，具有平喘、祛痰、抗菌、消炎等活性［2－4］.艾葉油化學(xué)成分復(fù)雜，且各成分含量隨產(chǎn)地及提取方式的不同有很大差異［5－6］，其中桉油精、樟腦、龍腦是普遍含量較高的3種主要活性成分.《中國(guó)藥典》（2010版）對(duì)艾葉的質(zhì)量控制考察了桉油精的含量，也有研究報(bào)道了艾葉中龍腦和石竹烯的含量測(cè)定［7］，但現(xiàn)有文獻(xiàn)還未見能同時(shí)測(cè)定艾葉油質(zhì)量的桉油精、樟腦、龍腦3種成分含量方法的報(bào)道.故本文采用GC法建立了同時(shí)測(cè)定艾葉油中桉油精、樟腦、龍腦含量的研究方法，以更全面、準(zhǔn)確、有效地控制艾葉油及其制劑的質(zhì)量.

1 儀器與試劑

Agilent 6890N氣相色譜儀和Agilent B.01.01C化學(xué)工作站（美國(guó)Aligent公司）；CA－1型靜音無油空氣泵、CH－1高純氫氣發(fā)生器（武漢科林普豐儀器有限公司）；AB265－S型1／10萬電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）.

桉油精對(duì)照品（批號(hào)：110788－201105）、樟腦對(duì)照品（批號(hào)：110747－201008）、龍腦對(duì)照品（批號(hào)：110881－201107），以上對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙醇、環(huán)己酮均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；艾葉揮發(fā)油（不同批次艾葉水蒸氣蒸餾法自提獲得，簡(jiǎn)稱艾葉油）.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP－INNOWAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；FID檢測(cè)器溫度：280℃；程序升溫：初溫110℃（保持8 min），以25℃·min－1升至158℃（保持8 min），再以25℃·min－1升至230℃（保持9 min）；載氣：氮?dú)猓髁浚?.7 m L·min－1（0.12 MPa）；氫氣流量：40 m L·min－1；空氣流量：450 m L·min－1；分流比10∶1，進(jìn)樣量：1μL.

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取環(huán)己酮適量，加乙醇制成每1 m L含1.40 mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液.2.2.2對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 精密稱取桉油精、樟腦、龍腦對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 m L分別含桉油精9.28 mg、樟腦2.00 mg、龍腦1.80 mg的對(duì)照品溶液.

2.2.3 混合對(duì)照品溶液 精密吸取桉油精、樟腦、龍腦對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，加乙醇制成每1 mL含桉油精0.975 5 mg、樟腦0.200 0 mg、龍腦0.223 2 mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液.再精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量與內(nèi)標(biāo)溶液1 m L于5 mL量瓶中，用乙醇稀釋定容，搖勻即得.

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液 取內(nèi)標(biāo)溶液適量，用乙醇稀釋，搖勻即得.

2.2.5 供試品溶液 精密稱取艾葉油適量，加乙醇制成每1 m L含艾葉油2.632 mg的供試品貯備液；再取供試品貯備液適量與內(nèi)標(biāo)溶液1 m L于5 m L容量瓶中，用乙醇定容，搖勻即得.

2.3 方法的專屬性

分別吸取混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各1μL，注入氣相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖.結(jié)果見圖1.結(jié)果表明，供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間位置上有相應(yīng)的吸收峰，陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無干擾.

A.混合對(duì)照品；B.陰性對(duì)照品；C.艾葉油供試品；1.桉油精（0.439 0 mg·mL－1）；2.環(huán)己酮（0.280 0 mg·mL－1）；3.樟腦（0.090 0 mg·mL－1）；4.龍腦（0.100 4 mg·mL－1）.圖1 氣相色譜圖A.mixed reference substance；B.negative control；C.essential oil from Artemisia argyi sample；1.eucalyptol（0.4390 mg·mL－1）；2.cyclohexanone（0.2800 mg·mL－1）；3.camphor（0.0900 mg·mL－1）；4.borneol（0.1004 mg·mL－1）.Fig.1 GC chromatograms

2.4 線性關(guān)系與范圍

按2.2.3項(xiàng)下制備不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液6份.按上述色譜條件每個(gè)濃度分別測(cè)定2次.以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得桉油精、樟腦、龍腦的線性回歸方程分別為：Y＝3.9689 X＋0.0113，Y＝4.1289 X＋0.0021，Y＝4.2625 X＋0.0028，r值均為1.000 0.結(jié)果表明，桉油精、樟腦、龍腦分別在48.78～731.6μg·mL－1，10.00～150.0μg·mL－1，11.16～167.4μg·mL－1的濃度范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.5 最低檢測(cè)限及定量限

分別將3種對(duì)照品儲(chǔ)備液逐步稀釋進(jìn)樣，至S／N（信噪比）≈3與S／N≈10，測(cè)得桉油精、樟腦、龍腦的最低檢測(cè)限分別為1.05 ng，0.64 ng，0.72 ng.定量限分別為3.14 ng，2.57 ng，2.87 ng.

2.6 日內(nèi)精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液1份，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算各對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，考察其進(jìn)樣精密度.計(jì)算桉油精、樟腦、龍腦的RSD分別為0.06%，0.44%，0.57%.結(jié)果表明，該方法日內(nèi)精密度良好.

2.7 日間精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液1份，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5 d，每天測(cè)定1次，計(jì)算各對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，考察其進(jìn)樣精密度.計(jì)算桉油精、樟腦、龍腦的RSD分別為：0.08%、0.28%、0.32%，結(jié)果表明，該方法日間精密度良好.

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h測(cè)定同一供試品溶液，計(jì)算桉油精、樟腦、龍腦與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值.計(jì)算桉油精、樟腦、龍腦的RSD分別為0.12%，0.68%，1.01%.結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的艾葉油適量，按2.2.5項(xiàng)下制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算桉油精、樟腦、龍腦與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值.計(jì)算桉油精、樟腦、龍腦的RSD分別為0.85%，1.03%，1.42%.結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好.

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的艾葉油樣品9份，按低、中、高濃度分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，每一濃度3份，按2.2.5方法制備溶液，按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1.

表1 桉油精、樟腦、龍腦加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n＝9）Tab.1 Results of recovery test of eucalyptol，camphor and borneol（n＝9）

2.11 樣品含量測(cè)定

取3批艾葉油樣品適量，分別按2.2.5方法制備供試品溶液各3份，按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，取平均值，結(jié)果見表2.

表2 不同批次艾葉油的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of eucalyptol，camphor and borneol in different samples（n＝3）

3 討論

在實(shí)驗(yàn)條件的探索階段，筆者考察了3根不同商品規(guī)格的毛細(xì)管色譜柱Agilent HP－5（30 m×0.32 mm×0.25μm）、Agilent HP－INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.5μm）、Agilent HP－INNOWAX（30 m×0.32 mm×0.25μm），結(jié)果僅有Agilent HP－INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.5μm）毛細(xì)管色譜柱能使桉油精、樟腦、龍腦及內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮達(dá)到基線分離（峰分離度均大于1.5）；理論塔板數(shù)均大于10000，符合藥典要求.因此以Agilent HPINNOWAX（30 m×0.25 mm×0.5μm）毛細(xì)管色譜柱作為本試驗(yàn)色譜柱.

由于艾葉油成分復(fù)雜，使用恒定柱溫?zé)o法同時(shí)使桉油精、樟腦、龍腦完全分離，筆者經(jīng)多次試驗(yàn)最終選用了文中的程序升溫條件.在綜合考慮分離度跟分析時(shí)間的前提下，最終選用了0.7 mL·min－1的載氣流速.

由于手動(dòng)進(jìn)樣無法精確保證進(jìn)樣量的一致性，故本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法定量，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)環(huán)己酮保留時(shí)間適當(dāng)且對(duì)其他峰無干擾，適合作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)物.

4 結(jié)論

從艾葉油含量測(cè)定結(jié)果可以看出，不同批次的艾葉所提艾葉油中桉油精、樟腦和龍腦成分含量高低不一，單單監(jiān)測(cè)其中的一種成分無法全面客觀地評(píng)價(jià)艾葉油的質(zhì)量好壞，故要控制艾葉油的質(zhì)量需對(duì)這3個(gè)組分進(jìn)行同時(shí)檢測(cè).

由于艾葉油的多種可靠功效，對(duì)其進(jìn)行開發(fā)使用正方興未艾，以它為主要成分生產(chǎn)的制劑日益增多，對(duì)其制劑的質(zhì)量控制亦會(huì)有更高的要求.本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便可靠，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可為艾葉油及其制劑的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù).

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：82.

［2］ 黃學(xué)紅，謝元德，朱婉萍，等.艾葉油治療慢性支氣管炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.浙江中醫(yī)雜志，2006，41（12）：734－735.

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［7］ 王 芳，王 俊，傅秀娟.毛細(xì)管GC法同時(shí)測(cè)定艾葉中石竹烯與龍腦的含量［J］.中國(guó)藥房，2012，23（27）：2551.