傷寒沙門菌Mig－14蛋白部分密碼子優(yōu)化后的表達(dá)及多克隆抗體制備

張 紅，生秀梅，徐順高，黃新祥，許化溪

（江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi簡(jiǎn)稱S.Typhi）是一種具有鞭毛的革蘭陰性人類腸道致病菌，經(jīng)消化道感染后可以引起全身系統(tǒng)性疾病——傷寒熱［1］.mig－14是S.enterica從S.bongori譜系中分離出來(lái)時(shí)通過(guò)水平轉(zhuǎn)移從大腸埃希菌（Escherichia coli，簡(jiǎn)稱E.coli）中獲得，隨后II（Salamac）型和IV（Houtenae）型S.enterica丟失該基因，故而，mig－14只存在于I型、Ⅲa型和IIIb型沙門菌的染色體上，是引起傷寒熱的致命性感染因素［2］.mig－14是一種獨(dú)立的致病因子，它的表達(dá)受到宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響，在沙門菌感染早期不發(fā)揮新陳代謝作用或管家基因的作用［3］，Valdivia等人發(fā)現(xiàn)mig－14對(duì)沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生存有作用［2］.mig－14具有拮抗PB的功能，其作用機(jī)制尚不明確.序列分析顯示，mig－14與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白AraC家族有一定的同源性［4］，提示它可能是一種調(diào)節(jié)蛋白.

為了探尋Mig－14拮抗PB的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室嘗試將mig－14基因克隆至表達(dá)載體p ET22b（＋），并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌JM109中進(jìn)行表達(dá)，但始終得不到表達(dá)產(chǎn)物.經(jīng)密碼子偏好性分析發(fā)現(xiàn)mig－14基因中含有大量稀有密碼子（8%）.密碼子偏愛(ài)性在原核基因異源表達(dá)中是一個(gè)很重要的影響因素.一般情況下，異源基因包含的密碼子在特定宿主中的利用率越低，該種蛋白的表達(dá)量也就越少，而通常采用的解決策略是優(yōu)化目標(biāo)基因中的稀有密碼子，在不改變氨基酸序列的前提下，將低利用率的密碼子替換為宿主常用密碼子來(lái)提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平.

本研究首次采用密碼子優(yōu)化策略對(duì)mig－14基因在大腸桿菌中進(jìn)行全序列的基因優(yōu)化，借助此法，成功克隆表達(dá)了Mig－14蛋白周質(zhì)空間部分（Mig－14－p），并制備了相應(yīng)的兔抗重組蛋白mig－14－p的多克隆抗體.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 傷寒沙門菌野生菌S.Typhi GIFU10007由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng)；E.coli JM109（DE3）和原核表達(dá)質(zhì)粒p ET22b（＋）由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性家兔2只，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

1.1.3 主要試劑與材料 DNA聚合酶r Taq、2.5 mmol d NTP限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、BSA、DL 2000標(biāo)準(zhǔn)Marker、T4DNA連接酶均為Ta KaRa（大連）公司產(chǎn)品；DNA聚合酶pfu和預(yù)染的蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；IPTG為Promega公司產(chǎn)品.

1.1.4 主要儀器 PCR儀，2720 Thermal Cycler（ABI），凝膠成像分析系統(tǒng)和垂直電泳儀（Bio－Rad），核酸檢測(cè)儀（NanoDrop），恒溫?fù)u床MAXQ 4000（Thermo），冷凍高速離心機(jī)：MULTIFUGE X1R（Thermo），JY92－IIDN超聲破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 密碼子的優(yōu)化 mig－14基因（897 bp）的密碼子在大腸桿菌中的優(yōu)化根據(jù)大腸桿菌中密碼子的使用頻率利用軟件Ge MS［5］進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)化后的密碼子未改變氨基酸的序列，密碼子優(yōu)化貫穿于整條基因序列，由南京金斯瑞公司合成.

1.2.2 目的基因的獲得 根據(jù)合成的mig－14基因序列，利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物P－mig－14－p－A／B，并分別在引物5′端加接NcoⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)序列，P－mig－14－p－A：GCCCATGGCAGTGAAGATCCAAGAAGTG（下劃線為NcoⅠ酶切位點(diǎn)），P－mig－14－p－B：GCCTCGAGCAGCTGGCTGAAAAAGTT（下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）.以合成的mig－14基因?yàn)槟０澹琍－mig－14－p－A／B為引物，利用高保真DNA聚合酶pfu對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增.

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 酚仿－乙醇法純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體p ET22b（＋）經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)酚仿－乙醇法純化后用T4DNA連接酶16℃連接3 h，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化入E.coli JM109，次日從平板上挑取12個(gè)菌落接種于含氨芐西林的LB平板上，37℃培養(yǎng)8 h后，將上述菌體和空載體轉(zhuǎn)化菌體收集于含30μL蒸餾水的EP管中，再加入等體積的酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1）混合液，在振蕩器上劇烈振蕩，離心后取10μL上清，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳觀察質(zhì)粒大小，初步篩選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，提取初篩陽(yáng)性克隆質(zhì)粒經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切驗(yàn)證后，通過(guò)DNA測(cè)序分析最終確認(rèn)（測(cè)序分析由上海生工生物技術(shù)公司完成）.

1.2.4 重組蛋白的表達(dá) 分別挑取含重組質(zhì)粒p ET22b（＋）－mig－14－p和空質(zhì)粒p ET22b（＋）的E.coli JM109單菌落于2 m L LB液體培養(yǎng)基中（氨芐西林100μg／m L），37℃振搖過(guò)夜.次日以1∶100比例轉(zhuǎn)接入20 m L的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖至OD600為0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，30℃振搖4 h，冰浴10 min后收集菌體，洗滌后用500μL PBS緩沖液重懸菌液，取出100μL用于全菌蛋白電泳，剩余菌液4℃超聲破碎，離心（12 000 r／min，15 min，4℃），取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳.

1.2.5 重組蛋白純化 按照目的蛋白相對(duì)分子量大小配置5%濃縮膠和12%分離膠，不插樣品梳上樣，按常規(guī)方法進(jìn)行電泳.電泳結(jié)束后將膠放置于預(yù)冷的KCl（250 mmol／L）溶液中，振搖染色至目的蛋白在膠塊上呈現(xiàn)1條白色的條帶，將此條帶切下，置于PBS緩沖液中漂洗脫去KCl.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步處理膠條：免疫動(dòng)物時(shí)，將膠條與適量佐劑混合后于冰上充分研磨粉碎，形成“油包水”狀即可免疫動(dòng)物；ELISA包被抗原時(shí)，將膠條切成小塊后置于EP管，加入少許PBS緩沖液振蕩混勻，－20℃反復(fù)凍溶3次，4℃，離心（13 500 r／min，15 min，4℃），取上清用于ELISA實(shí)驗(yàn)［6］.

1.2.6 Mig－14－p的抗原性分析 將Mig－14－p序列輸入計(jì)算機(jī)，利用Antherprot［7］軟件按照Parker et al［8］報(bào)道的方法進(jìn)行抗原性分析.

1.2.7 兔抗Mig－14－p蛋白多克隆抗體的制備

制備足量的乳化抗原，背部皮下多點(diǎn)注射法免疫家兔.初次免疫前采集兔耳緣靜脈血液，取血清作陰性對(duì)照，第1次免疫后每隔2周免疫家兔，共免疫4次，末次免疫1周后頸動(dòng)脈放血并獲得抗血清.分裝保存于－20℃.ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)，用免疫印跡法檢測(cè)抗體的特異性.

2 結(jié)果

2.1 mig－14－p基因設(shè)計(jì)及合成

對(duì)來(lái)源于傷寒沙門菌野生株S.Typhi GIFU10007的mig－14基因進(jìn)行密碼子分析，發(fā)現(xiàn)其存在很多大腸桿菌稀有密碼子，如表2－1.推測(cè)通過(guò)對(duì)mig－14基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，可能會(huì)實(shí)現(xiàn)Mig－14蛋白的表達(dá).故本研究根據(jù)密碼子的使用頻率（http：／／www.kazusa.or.jp／e／index.html）、GC含量、限制性酶切位點(diǎn)以及編碼每一個(gè)氨基酸各個(gè)密碼子所占的比重，使用Ge MS軟件，對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化［5］.優(yōu)化前后mig－14的密碼子分布如表1所示.

表1 大腸桿菌密碼子的使用頻率及優(yōu)化前后mig－14基因密碼子的使用頻率Tab.1 Codon preference in E.coli and codon usage in the wild type and the optimized synthetic mig－14 gene

2.2 傷寒沙門菌p ET22b（＋）－mig－14－p重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以合成的mig－14為模板，PCR擴(kuò)增獲得約615 bp的DNA片段，將此片段用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后與表達(dá)載體p ET22b（＋）相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli JM109，篩選帶有陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的菌株，從中提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒p ET22b（＋）－mig－14－p，經(jīng)PCR和NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，證明mig－14－p基因已經(jīng)成功連接到表達(dá)載體p ET22b（＋）上（圖1）.

圖1 p ET22b（＋）－mig－14－p重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Preparation of the p ET22b（＋）－mig－14－p plasmid

2.3 重組蛋白Mig－14－p的表達(dá)與純化

重組蛋白pET22b（＋）－Mig－14－p在大腸埃希菌JM109中成功表達(dá)，主要以包涵體形式存在.經(jīng)過(guò)KCl染色，在相對(duì)分子量為25×103Da處發(fā)現(xiàn)與目的蛋白理論預(yù)測(cè)值相符的蛋白表達(dá)帶，利用切膠法純化該蛋白，從而獲得大量的目的蛋白（圖2、圖3）.

圖2 重組蛋白Mig－14－p表達(dá)與純化的電泳鑒定Fig.2 SDS－PAGE analysis of recombinant protein Mig－14－p expression and purification

圖3 重組Mig－14－p蛋白KCl染色Fig.3 Recombinant Mig－14－p by KCl stain

2.4 兔抗Mig－14－p蛋白的多克隆抗體制備

Mig－14是一種膜定位蛋白，本實(shí)驗(yàn)室嘗試表達(dá)全長(zhǎng)，始終未能獲得表達(dá)產(chǎn)物，應(yīng)用Antherprot軟件對(duì)Mig－14進(jìn)行抗原性分析，發(fā)現(xiàn)Mig－14序列上129～165位間抗原性預(yù)測(cè)值較高，這一區(qū)域位于Mig－14周質(zhì)空間部分.因此我們表達(dá)了Mig－14周質(zhì)部分，將經(jīng)KCl染色切膠純化的Mig－14－p蛋白免疫家兔制備兔抗Mig－14－p的多克隆抗體，ELISA測(cè)定純化后的抗體效價(jià)為1∶64000，蛋白質(zhì)印跡顯示多克隆抗體與抗原反應(yīng)的特異性較好（圖4）.

圖4 免疫印跡法檢測(cè)抗體的特異性Fig.4 Western－blotting analysis of the anti－Mig－14－p polyclonal antibody

3 討論

外源基因密碼子的選用對(duì)異源蛋白表達(dá)具有重要影響，采用宿主偏愛(ài)的密碼子，因其有較高的與宿主細(xì)胞的t RNA水平匹配度，可以提高翻譯的效率［9］，而且越來(lái)越多的證據(jù)表明，同義密碼子的改變可通過(guò)改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞tRNA水平的匹配度，從而提高異源蛋白的表達(dá)量［10－11］.本研究在不改變?cè)璏ig－14氨基酸序列的情況下，首次嘗試?yán)孟到y(tǒng)密碼子優(yōu)化的方法設(shè)計(jì)合成mig－14基因，成功表達(dá)了Mig－14－p蛋白.

本研究利用KCl染色切膠法純化蛋白，獲得了較高濃度的目的蛋白，并成功免疫家兔，制備了相應(yīng)的多克隆抗體.與傳統(tǒng)的純化包涵體蛋白方法相比，KCl染色切膠純化法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）簡(jiǎn)單易行：省去了多次洗脫親和層析柱的繁瑣工作，操作簡(jiǎn)單.2）經(jīng)濟(jì)實(shí)用：無(wú)需昂貴的蛋白純化柱，降低了實(shí)驗(yàn)成本.3）快速省時(shí)：一次可以純化大量的蛋白，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間.KCl染色切膠免疫方法的應(yīng)用為包涵體形式存在蛋白的多克隆抗體制備提供了一種便利方法［12］.

本研究根據(jù)優(yōu)化后的mig－14基因，首先嘗試了表達(dá)Mig－14蛋白，但是盡管不斷優(yōu)化表達(dá)條件，仍未見(jiàn)Mig－14蛋白的表達(dá).而通過(guò)Antherprot軟件對(duì)Mig－14進(jìn)行抗原性分析，發(fā)現(xiàn)Mig－14序列上129～165位間抗原性預(yù)測(cè)值較高，這一區(qū)域位于Mig－14周質(zhì)空間部分.因此我們表達(dá)了Mig－14－p并制備相應(yīng)兔抗重組蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究Mig－14的分子功能提供了基礎(chǔ).

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