遺傳性泛發性色素異常癥ABCB6基因突變檢測

劉 丹付希安暴芳芳史本青劉 紅田洪青張福仁?

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遺傳性泛發性色素異常癥ABCB6基因突變檢測

劉 丹1，2，3付希安1暴芳芳1史本青1劉 紅1田洪青1張福仁1?

目的: 檢測3例遺傳性泛發性色素異常癥患者ABCB6基因的突變。方法: 提取患者外周血DNA，采用PCR擴增患者ABCB6基因的全部外顯子及其側翼序列，對PCR擴增產物直接測序檢測基因突變。結果: 3例患者該基因編碼區所有外顯子均未發現突變。結論: 本研究中3例遺傳性泛發性色素異常癥患者的發病與ABCB6基因的編碼區序列無關。

遺傳性泛發性色素異常癥； ABCB6基因； 突變位點

遺傳性泛發性色素異常癥(DUH)是由德國學者Lchikawa和Hiraga于1933年首次報道的一種少見的孟德爾遺傳性皮膚病，其典型皮損為全身泛發相互夾雜的色素沉著和色素減退斑。1本病呈常染色體顯性或隱性遺傳。DUH作為一種遺傳性疾病，其表型改變是以基因的改變為基礎，因此尋找其致病基因不僅可以對疾病做出明確診斷，而且可以在分子水平更好的認識其發病機制。2003年賀林等首次將顯性遺傳DUH的致病基因定位于6q24.2～q25.2區域，2隱性遺傳DUH的致病基因定位于12q21～q23區域。3，42013年Zhang等運用全基因組聯合分析及外顯子測序的方法首先發現ABCB6基因為DUH的致病基因。5同時，我們的研究團隊也運用相似的方法得出相同的結論，并且用模式動物斑馬魚實驗驗證致病基因ABCB6的表達。6為進一步驗證ABCB6為DUH的致病基因，我們對收集到的2個DUH家系的先證者及1例散發共3例患者進行ABCB6基因突變位點檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象 3例DUH患者來自山東省皮膚病性病防治研究所門診，均經臨床和病理確診。2個DUH家系的家系圖如圖1所示:患者父母之一發病，男女發病機會大致均等；男女患者均可直接傳遞給后代且代代相傳，符合單基因遺傳中常染色體顯性遺傳的方式。家系中先證者及1例散發病例的平均發病年齡為2歲。典型的臨床表現:全身泛發大小性狀不等色素斑，色素沉著與色素減退相互夾雜，無自覺癥狀(圖2)。組織病理學示:色素沉著區基底細胞甚至真皮層黑素增加；色素減退區黑素數量明顯減少甚至缺如(圖3)。

圖1 家系圖(a:家系1；b:家系2)

圖2 a、b:散發病例的肩部及背部泛發大小形狀不等色素斑，色素沉著與色素減退相互夾雜圖3 散發病例背部組織病理示:色素沉著區基底細胞甚至真皮層黑素增加；而色素減退區黑素數量明顯減少(HE，×400)

1.2 材料 經患者知情同意后，留取詳細的臨床資料和臨床圖片及組織病理檢查結果，同時取患者靜脈血各5 mL，放置在EDTANa4抗凝管中，存入－70℃冰柜冷凍保存，采用AXYGEN試劑盒提取基因組DNA。取適量DNA進行純度檢測并標化。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴增 通過美國國家生物信息中心(NCBI)基因庫及UCSC數據庫檢索到ABCB6基因的基因組序列，采用Premier Primer 5.0軟件設計合適的引物，由北京華大基因科技有限公司合成(表1)。按照說明書將其稀釋為20μmol/L，并采用溫度梯度法探索每一對引物的最佳退火溫度。PCR反應在9700型PCR擴增儀(美國ABI公司)上完成，反應條件為: 94℃預變性3 min后，94℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環。最后72℃延伸8 min，4℃保存。

表1 本研究中設計的引物

1.3.2 DNA測序 PCR產物采用3130xl遺傳分析儀(美國ABI公司)直接測序。

2 結果

直接測序結果ABCB6基因整個編碼區的19條外顯子及其側翼序列被擴增，并且個別外顯子采用了雙向測序，以確保測序結果的準確性。3例患者的DNA測序結果中均未發現突變位點(圖4為散發病例12號外顯子的一段正常序列)。

圖4 散發病例12號外顯子的一段正常序列，箭頭所指為文獻5中報道的突變位點c.1736 G＞A(p.Gly579Glu)

3 討論

DUH是一種少見的色素異常性皮膚病，其典型皮損為全身泛發色素沉著伴色素減退斑。該病的診斷主要依靠臨床表型及組織病理學檢查，但臨床存在許多與其表型相類似的色素異常性疾病，如遺傳性對稱性色素異常癥(DSH)、網狀肢端色素沉著(RAPK)、屈側網狀色素異常癥(DDD)等，給臨床診斷帶來一定困難。而遺傳性疾病的表型改變往往以基因的改變為基礎，因此確定疾病的致病基因尤為重要。

早在2003年賀林等就首次將顯性遺傳及隱性遺傳DUH的致病基因分別定位于6q24.2～q25.2和12q21～q23區域，但均未發現致病基因。

2013年Zhang等5首先通過連鎖分析及相關的功能分析發現該病的致病基因為ABCB6且該基因在皮膚的表皮表達。Cui等7通過連鎖分析及外顯子測序技術進一步驗證了ABCB6基因為DUH的致病基因，并認為不同位置的突變位點可以產生不同的表型。

ABCB6基因位于2號染色體2q36區域，屬于ABC轉運超家族，參與轉運多肽、類固醇等。8該基因表達于多種組織，如心臟、骨骼肌、黑素細胞及黑素瘤細胞等。8ABCB6亞細胞定位于內質網、高爾基體、溶酶體及質膜。9，10既往研究發現DUH可能與黑素細胞成熟障礙相關。我們的動物模式斑馬魚實驗表明ABCB6在黑素的轉運及生成方面發揮著極其重要的作用。6

迄今已發現7個DUH相關的ABCB6基因突變位點(表2)，但本研究中3例患者所有ABCB6基因編碼區域及側翼序列均未發現突變。我們推測可能的原因:一是突變位點可能位于啟動子區域，而我們并沒有檢測所有的內含子區域。二是該病可能存在其他致病基因。下一步我們會對非編碼區進行測序，檢測內含子區域是否存在突變。

表2 文獻中報道的關于顯性遺傳DUH的致病基因ABCB6突變位點

1 Ichigawa T，Hiraga Y.A previously undescribed anomaly ofpigmentation dyschromatosis universalis hereditaria.J Dermatol，1933，34:360－364.

2Xing QH，Wang MT，Chen XD，etal.A gene locus responsible for dyschromatosis(DSH)maps to chromosome 6q24.2－q25.2. Am JHum Genet，2003，73:377－382.

3 Bukhari IA，El－Harith EA，Stuhrmann M.Dyschromatosis universalis hereditaria as an autosomal recessive disease in five members of one fam ily.JEur Acad Dermatol Venereol，2006，20 (5):628－629.

4 Stuhrmann M，Hennies HC，Bukhari IA，et al.Dyschromatosis universalis hereditaria:evidence for autosomal recessive inheritance and identification of a new locus on chromosome 12q21－q23.Clin Genet，2008，73(6):566－572.

5 Zhang C，LiD，Zhang J，etal.Mutations in ABCB6 Cause Dyschromatosis Universalis Hereditaria.J Invest Dermatol，2013，133 (9):2221－2228.

6 Liu H，Li Y，Hung KKH，et al.Genome－wide linkage，exome sequencing and functional analyses identify ABCB6 as the pathogenic gene of dyschromatosis universalis hereditaria.PLoSOne，2014；9(2):87250.

7 Cui YX，Xia XY，Zhou Y，etal.Novelmutations of ABCB6 associated with autosomal dominant dyschromatosis universalis hereditaria.PLoSOne，2013，8(11):79808.

8Mitsuhashi N，Miki T，Senbongi H，et al.MTABC3，a novel mitochondrial ATP－binding cassette protein involved in iron homeostasis.JBiol Chem，2000，275:17536－17540.

9 Tsuchida M，Emi Y，Kida Y，et al.Human ABC transporter isoform B6(ABCB6)localizes primarily in the Golgi apparatus. Biochem Biophys Res Commun，2008，369(2):369－375.

10 Kiss K，Brozik A，Kucsma N，etal.Shifting the paradigm:the putativemitochondrial protein ABCB6 resides in the lysosomes of cells and in the plasma membrane of erythrocytes.PLoS One，2012，7(5):37378.

(收稿:2014－03－20 修回:2014－05－04)

M utation detection of ABCB6 gene w ith dyschromatosis universalis hereditaria

LIU Dan，FU Xi-an，BAO Fang-fang，et al.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，250022，Jinan

Objective:To identifymutations of ABCB6 gene in three patientswith dyschromatosis universalis hereditaria.Methods:After extracting DNA from peripheral blood，all the exonsof ABCB6 geneand their flanking intronic sequences were amplified by PCR，and then，direct sequencing was performed to screen the mutations in the gene.Results:Nomutation was found in any of the exon in ABCB6 gene from the three patients.Conclusion:The pathogenesis of the three patients with dyschromatosis universalis hereditaria has nothing to do with the sequence of coding region in ABCB6 gene.

dyschromatosis universalis hereditaria；ABCB6 gene；mutations

1山東省皮膚病性病防治研究所，濟南，250022

2山東省醫學科學院，濟南，250062

3濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南，250062

?通信作者