溫度、鹽度和pH對小球藻生長率的聯合效應

劉加慧 楊洪帥 王 輝(廣東海洋大學水產學院, 湛江 524088)

溫度、鹽度和pH對小球藻生長率的聯合效應

劉加慧 楊洪帥 王 輝(廣東海洋大學水產學院, 湛江 524088)

采用中心復合設計(CCD)研究了溫度(16—34 ℃)、鹽度[(15—45)‰]和pH(6.0—9.0)對小球藻(Chlorella sp. CHX-1)生長的聯合效應。結果表明, 溫度、鹽度與pH的一次、二次效應都對小球藻比生長速率有極顯著影響(P<0.01); 溫度與鹽度間、溫度與pH間的互作效應對小球藻比生長速率影響顯著(P<0.05), 而鹽度與pH間的互作效應影響不顯著(P>0.05); 三因子影響度大小依次為: 溫度>pH>鹽度。采用響應曲面法建立了溫度、鹽度和pH對小球藻比生長速率影響的模型方程, 該模型的決定系數0.9759, 矯正決定系數0.9542, 說明模型的擬合度極高; 模型的預測決定系數0.8367, 表明可用于預測小球藻比生長速率的變化。通過模型優化和驗證試驗, 得出在溫度、鹽度和pH組合為26.7 ℃/25.5‰/7.3時, 小球藻比生長速率達到最大值0.69, 滿意度為0.999。本試驗結果可為小球藻生產提供理論指導。

小球藻; 溫度; 鹽度; pH; 生長; 響應曲面法

小球藻(Chlorella)是一種常見的單細胞綠藻,廣泛分布于各種水體。小球藻富含藻多糖、脂肪酸、糖蛋白和維生素等營養成分, 可以作為全營養食品提供給人類, 有較好的藥理和保健作用[1,2], 是培育輪蟲和貝類等的重要餌料[3,4], 也是去除污水 N、P等物質效率最高的藻類之一[5,6]。此外小球藻還可用于生產生物柴油[7—9]。

為了更充分的利用小球藻, 首先要提高小球藻的生產力。藻類生長與藻本身的生理特點以及諸多環境因素有關, 其中水體溫度、鹽度和pH是影響藻類生長的重要環境因子。關于環境因子對小球藻生長的影響國內外已有許多報道, 如楊桂娟等[10]研究了溫度對小球藻生長和溶氧量的影響, 表明在 25℃時, 小球藻生長速度與溶氧量的增長速度達到最大。杜宇等[11]報道了小球藻在低鹽環境中有較快的生長速度。Rai, et al.[12]發現酸性pH會抑制營養物NO3+、NH4+的吸收和硝酸還原酶活性進而影響其生長。趙娜等[13]研究了不同pH條件下Cr6＋對小球藻生長的毒性效應, 發現Cr6+在藻的最適生長pH條件下毒性最小。張桂艷等[14,15]研究了不同理化因子對小球藻生長速率、生物量和油脂產量的影響, 發現溫度、鹽度和 pH的影響表現為在適宜生長的條件下油脂含量提高。De-Bashan, et al.[16]研究發現氮的吸收取決于小球藻的生長情況。這些研究都說明研究適宜小球藻生長的環境因子是很有必要的。但以上研究僅局限于單因子的研究, 不能考察影響因子之間的互作或協同效應, 也沒有建立起可用于預測的模型。本研究采用中心復合設計和響應曲面分析法,擬研究溫度、鹽度和 pH對小球藻生長的聯合效應,考察溫度、鹽度和pH的一次、二次效應及互作效應,建立相應的回歸模型, 并通過模型優化找到最優因子組合, 為其進一步的生產培養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養方法

試驗用小球藻: 采用廣東海洋大學藻種室提供的小球藻(Chlorella sp. CHX-1)。小球藻保種于 f/2液體培養基, 4℃冰箱。

培養方法: 小球藻經長時間保存其活力會下降,故正式試驗前應先進行活化培養。先將小球藻接種于f/2培養基培養4d進行活化。每天搖瓶5—6次, 防止藻細胞下沉或附壁。培養溫度25 , ℃ 光照40 μmol/ (m2·s), 光暗比 12h∶12h。將進入對數期的藻種離心、洗凈后接入裝有50 mL f/2培養液[17]的100 mL錐形瓶, 使初始OD值在0.1—0.2。置于GZX-150C光照培養箱內在不同溫度下進行一次性培養(控溫精度0.1 ), ℃ 中間不更換培養液。用NaCl調節藻液鹽度, 1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調節藻液pH, 并每隔4h監測一次水體pH變化, 用Tris-HCl緩沖液校正, 以保證試驗過程中 pH變化不超過±0.2。每天搖動錐形瓶兩次(09:00和17:00), 隨機調換錐形瓶的位置使受光均勻。藻種接種及培養過程中, 均嚴格遵循無菌操作。

1.2 試驗設計

采用中心復合法試驗設計(Central composite design, CCD)研究溫度、鹽度和pH對小球藻生長的聯合效應。根據預試驗的結果, 本試驗中溫度范圍為16—34 , ℃ 鹽度范圍為(15—45)‰, pH范圍為6.0—9.0。溫度(T)、鹽度(S)和pH在上述范圍內各取5個水平, 各因子水平的編碼值分別是–1.68179、–1、0、1、1.68179。整個試驗共計20個溫度、鹽度和pH三因子交叉組合(表1), 其中因子點數為8個, 軸點數6個, 星號臂α= ±1.68179, 中心點數為6。每個因子點和軸點組合重復3次(表1)。為消除系統誤差, 所有因子組合均隨機安排。

表1 試驗設計與相應結果Tab. 1 Experimental design and results

1.3 生長測定

取小球藻藻液, 用分光光度計測其在680 nm下的光密度值(OD680)[18,19], 以光密度值代表藻的生長情況。每天定時取樣測定, 每組設3個重復。接種后1—5d, 藻液OD值快速增長, 第6天, 增長速率明顯減緩, 6d以后OD值變化很小。所以, 用培養前6d的平均生長速率表示各種培養條件下的小球藻的比生長速率。比生長速率(Specific growth rate, SGR)根據普通生物學通用的計算公式[14]計算得到:

其中, K表示小球藻比生長速率; NT為時間T的OD值; N0是初始時的OD值; T為培養時間, 試驗期T為6d。

1.4 數據處理

以溫度、鹽度和pH三因子為自變量, 小球藻比生長速率為因變量, 建立小球藻比生長速率和溫度、鹽度、pH之間的回歸方程模型為:

式中, Y為響應變量(小球藻比生長速率); β0為常數; β1、β2、β3分別代表溫度、鹽度和pH的一次效應; β3、β4、β5分別代表溫度與鹽度間、溫度與pH間、鹽度與pH間的互作效應; β6、β7、β8分別代表溫度、鹽度和pH的二次效應; ε為殘差, 并假定其服從均值為0的正態分布。采用ANOVA方法檢驗模型的顯著性, 并給出幾種決定系數以輔助確定模型的擬合優度。采用SAS (v9.13)軟件中的 RSM 模塊對數據進行統計分析, 模型中的各項效應采用最小二乘法進行估計并采用F統計量進行顯著性檢驗。各因子對生長的影響可通過等高線圖展示。顯著水平設定為0.05。

2 結果

對應于各個溫度、鹽度和pH組合的生長結果如表1所示。由于每個因子點與軸點重復了3次, 故給出了生長數據的標準差; 而為進行模型的失擬檢驗及估計、降低純誤差, 本研究設置中心點次數為6,無需再設重復組, 因此沒有給出標準差。從結果看,由于試驗中采取了嚴格控制因子波動范圍的措施,數據的精度較高。

2.1 模型檢驗

通過對模型進行方差分析(表2)可見, 方程模型極顯著(P<0.01), 失擬檢驗結果顯著(P<0.05), 可能是極小的純誤差造成的, 而非模型不恰當。

表2 模型充分性的方差分析Tab. 2 Analysis of variance for the adequacy of the model

2.2 模型建立

對系數進行顯著性檢驗結果表明(表3), 溫度、鹽度與pH的一次效應、二次效應對小球藻比生長速率影響極顯著(P<0.01), 溫度與鹽度、pH中任意一因子間的互作效應對小球藻比生長速率影響顯著(P<0.05), 鹽度與 pH間的互作效應對小球藻比生長速率影響不顯著(P>0.05)。由于表3中的系數估計值都是以編碼值的形式給出, 故可以直接比較各因子效應的大小。由表3可見, 溫度、鹽度與pH對小球藻比生長速率的影響度大小依次為: 溫度>pH>鹽度。

對試驗數據進行二次多元回歸擬合, 根據試驗得出的小球藻比生長速率與溫度、鹽度和pH之間的(即非編碼)回歸方程為:

該模型決定系數 R2為 0.9759, 矯正決定系數Adj.R2為0.9542, 預測決定系數Pred.R2為0.8367。由于本研究采用的試驗設計具有正交性, 因而上述模型方程中那些不顯著的項可直接剔除而不必重新估計各項系數。

2.3 響應曲面分析

從圖1、圖2、圖3可以看出, 當保持溫度、鹽度和 pH三個因子中的任何一個因子為最佳條件不變時, 隨著其他兩個因子的升高, 小球藻的比生長速率均呈先上升后下降的趨勢。圖1、圖2和圖3的等高線圖清晰的顯示了隨著這三個因子變化, 小球藻的比生長速率存在最佳范圍。

表3 回歸方程系數及95%置信區間估計Tab. 3 Coefficient estimate and 95% confidence intervals

圖1 溫度和鹽度對小球藻比生長速率影響的等高線圖Fig. 1 Contour plot of the combination effects of temperature and salinity on the growth rate of Chlorella sp. CHX-1

圖2 溫度和pH對小球藻比生長速率影響的等高線圖Fig. 2 Contour plot of the combination effects of temperature and pH on the growth rate of Chlorella sp. CHX-1

2.4 優化

本研究中得到的模型方程有很高的擬合度和預測能力, 根據Montgomery, et al.[20]的方法對小球藻比生長速率的模型方程進行優化。結果顯示, 溫度、鹽度和pH的最優組合為26.7 /25.5℃ ‰/7.3, 此時小球藻的比生長速率達到最大值 0.69, 滿意度為0.999。為了進一步驗證響應曲面優化條件的可靠性,按所得最優條件進行驗證試驗, 所得比生長速率為0.70, 與理論預測值基本相符, 說明模型優化條件合理有效。

圖3 鹽度和pH對小球藻比生長速率影響的等高線圖Fig. 3 Contour plot of the combination effects of salinity and pH on the growth rate of Chlorella sp. CHX-1

3 討論

3.1 溫度對小球藻生長的影響

溫度通過影響藻類光合作用與呼吸作用強度來影響其生長發育, 對經濟微藻的生長速率及生化組成造成顯著影響[21—23], 是影響藻類生長發育的重要環境因素。本試驗研究結果顯示, 溫度的一次效應對小球藻比生長速率影響極顯著(P<0.01), 溫度的效應大于鹽度、pH的效應, 與一些學者的研究發現[24,25]相一致。等高線圖(圖1和圖2)顯示, 在16—25℃溫度范圍內小球藻比生長速率呈上升趨勢, 在29.5—34℃內呈下降趨勢。與楊桂娟等[10]和吳松[26]提出的適宜溫度范圍一致。在一定溫度范圍內, 溫度較低時,細胞膜的運輸和呼吸代謝功能會受到影響,致使延遲期增加。但隨著溫度升高, 酶活性增強, 生長速率加快[27]。只有在適宜溫度范圍內, 藻類才會生長最快。有學者[14]證實在 15—35℃溫度范圍內,小球藻的比生長速率呈先上升后下降的趨勢。

3.2 鹽度對小球藻生長的影響

鹽度主要是調節微藻細胞胞內外的滲透壓, 影響微藻光合速率、葉綠素含量和一些代謝活動[28]。本試驗研究結果顯示, 鹽度的一次效應對小球藻比生長速率影響極顯著(P<0.01), 與Cho, et al.[24]的研究結果相符。等高線圖(圖1和圖3)顯示, 在(15—30)‰的鹽度范圍內小球藻比生長速率呈上升趨勢, 在(30—45)‰內呈下降趨勢。金偉[29]指出鹽度對單細胞藻生長的影響呈拋物線型, 鹽度過高或過低都不利于藻的生長, 這與圖1和圖3中的趨勢相似。江靈芝等[30]研究發現蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)在(15—45)‰鹽度范圍均可以正常生長, 以及韓志國等[31]報道小球藻(Chlorella minutissima)在鹽度15‰開始出現較典型的生長曲線, 在(20—50)‰鹽度范圍內均呈現典型的生長曲線, 與本試驗得出的鹽度范圍一致。

3.3 pH對小球藻生長的影響

pH值能改變微藻體內相關酶的結構狀態和活性、培養液中碳源的存在形式以及各種金屬復合物的溶解度, 從而影響微藻生長及脂肪酸的含量[12—15]。本試驗結果顯示, pH的一次效應對小球藻比生長速率影響極顯著(P<0.01), 等高線圖(圖2和圖3)顯示, pH為6.0—7.5時小球藻比生長速率呈上升趨勢, 7.5—9.0時呈下降趨勢, 與趙娜等[13]研究結果相符。在生長過程中, 小球藻會因自身生理代謝活動調節生活環境的pH[19,32], 小球藻喜歡弱堿性(pH7.2—8.2), 但在弱酸性(pH5.8—6.8)的水中也能生活和繁殖[33]。吳松[26]報道小球藻適宜生長的酸堿度為pH6—8左右, Matusiak, et al.[34]報道小球藻適宜生長的pH為7.0—8.0, 與本試驗結果相似。

3.4 溫度、鹽度和pH對小球藻生長的互作效應

以往的研究多集中于單因子[13—15]對小球藻生長的獨立影響, 因而這些研究不能考察多因子間的互作影響, 還有一些采用正交實驗[24,25]。當因子之間存在互作效應時, 對該交互作用的分析比單獨分析因素的主效應重要得多[20]。目前僅見Cho, et al.[24]采用雙因素方差分析法, 得出溫度和鹽度的互作效應對小球藻比生長速率影響極顯著。本試驗采用復合設計, 對溫度、鹽度、pH的互作效應進行顯著性檢驗。結果表明, 溫度與鹽度的互作效應以及溫度與 pH的互作效應對小球藻比生長速率影響顯著(P<0.05)。原因可能是溫度升高或降低均會影響小球藻體內酶的活性, 而此變化會影響小球藻滲透壓調節和酸堿平衡。但實驗結果中鹽度與 pH的互作效應對小球藻的比生長速率影響不顯著(P>0.05), 造成此結果的原因可能是, 滲透壓和酸堿平衡的調節是兩個獨立的過程, 不存在關聯。

3.5 優化

本研究表明, 溫度、鹽度和pH的二次效應對小球藻的比生長速率影響均極顯著(P<0.01), 溫度、鹽度、pH與小球藻比生長速率之間呈曲線關系。從圖1、圖2和圖3可見, 小球藻的生長存在峰值, 即當溫度、鹽度和pH組合不恰當時, 小球藻生長量會降低。從實際生產看, 確定溫度、鹽度、pH的最優組合對提高小球藻產量具有現實意義。以上引用文獻均未發現溫度、鹽度及 pH的二次效應。本試驗是基于可靠模型, 根據Montgomery, et al.[20]的方法對模型方程進行優化, 結果顯示, 當溫度、鹽度和 pH的組合為 26.7 /25.5℃ ‰/7.3時, 小球藻的比生長速率達到最大值0.69, 滿意度高達0.999。本試驗的研究結果是基于可靠的模型, 而以前的研究均未建立起可靠的模型, 故本試驗結果更可靠, 且與楊桂娟等[10]、吳松[26]報道的最適溫度, 韓志國[31]、Sultana, et al.[35]報道的最適鹽度以及王子敬[36]等報道的最適pH接近。Mayo, et al.[37]使用混合培養基培育普通小球藻的最適溫度值(32.4℃), Ertit, et al.[38]報道的 pH(8.0), 與本試驗結果相差很大。有資料證實藻種[23]、培養基[14,21]、光照強度及光暗周期[18,25]等都會影響藻的生長。所以很可能是藻株、培養基等生長體系和培養環境的不同造成了最適溫度、鹽度和pH的不同。

3.6 模型的建立及其意義

響應曲面法是通過響應曲面分析得到擬合度較高的模型方程, 并通過模型對試驗指標進行可靠的預測[20]。然而國內外關于環境因子對藻類生長影響的研究, 大多采用單因子[13—15,23]或正交實驗設計方法[24,25]。只針對環境因子的幾個孤立的水平點進行分析, 極少數地建立了單因子線性回歸方程[24],但無法對小球藻比生長速率進行連續預測。本研究首次建立了二次多元曲線回歸模型, 回歸方程的決定系數R2高達0.9759, 表明模型的擬合度很高。Cho, et al.[24]建立的小球藻生長模型相關系數R2≤0.97,顯然本模型擬合度更高。模型失擬檢驗結果顯著(P<0.05), 可能是極小的純誤差造成的(表2), 而非模型不恰當。然上述研究者的模型方程都沒有進行失擬檢驗, 無法判定其恰當性。更重要的是, 本研究中還給出了模型的預測能力, 預測R2為0.8367, 表明能可靠預測到不同溫度、鹽度和pH條件下小球藻的比生長速率。其他的模型方程均沒有給出此值,因而無法確定其預測能力。

本試驗建立了溫度、鹽度和 pH對小球藻比生長速率影響的模型, 得出了溫度、鹽度和pH最優組合, 為小球藻的培養生產提供了理論基礎。藻的生長離不開光照和氮、磷等營養元素, 在一般情況下,光照強度和培養基中的不同營養鹽及其濃度都對小球藻的生長有明顯影響, 然本試驗并未考慮, 優化小球藻生長條件還需要進一步探討。

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COMBINED EFFECTS OF TEMPERATURE, SALINITY AND pH ON THE SPECIFIC GROWTH RATE OF CHLORELLA

LIU Jia-Hui, YANG Hong-Shuai and WANG Hui
(Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

By using central composite design, the join effects of water temperature (16—34 ℃), salinity [(15—45)‰], and pH (6.0—9.0) on the growth of Chlorella sp. CHX-1 were examined in this study. The results showed that the linear and quadratic effects of temperature, salinity and pH on the specific growth rate (SGR) of Chlorella were significant (P<0.01). The interactive effect of temperature and salinity, interactive effect of temperature and pH were significant (P<0.05), but the interaction between salinity and pH was not significant (P>0.05). The effect of temperature on the SGR was greater than that of pH, which in turn was greater than that of salinity. Through response surface methodology, a model equation about the relationship of the growth rate to the three factors was established, with the R2, Adj.R2as highly as 0.9759 and 0.9542, suggesting that the fitting capability of the model was satisfactory. The Pred.R2reached to 0.8367, demonstrating that the model could be practicably applied for prediction. Through the optimization of the reliable model, the SGR reached its maximum (0.69) when the 3-factor combination was 26.7 ℃/ 25.5‰/7.3, with the desirability value being 0.999. These experimental results could offer theoretical reference for the production of the Chlorella.

Chlorella; Temperature; Salinity; pH; Specific growth rate; Response surface method

S968.41+9

A

1000-3207(2014)03-0446-08

10.7541/2014.63

2013-09-11;

2014-02-23

廣東省教育廳工程中心建設項目(GCZX-A0909); 國家星火計劃(2011GA780001)資助

劉加慧(1989—), 女, 河北邯鄲人; 碩士研究生; 主要從事海洋經濟動物發育生物學研究。E-mail: 13226267636@163.com

王輝(1966—), 男, 博士生導師; E-mail: whh524@sina.com