血管內皮生長因子對軟骨細胞凋亡的作用

朱世振 邱 波▲ 高明勇 宋其合 門海龍

1.武漢大學人民醫院骨科，湖北武漢 430060；2.湖北省新華醫院骨科，湖北武漢 430060

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是以關節軟骨細胞凋亡和細胞外基質進行性降解為主要病理特征的疾病。OA 的病因尚不完全清楚，研究證實OA 受累軟骨和滑膜中已發現多種血管生成介質，其中血管內皮生長子（vascular endothelia growth factor，VEGF）是血管生成的主要調節因子，探討VEGF 在關節軟骨中退變的作用，特別是以VEGF 為靶向的骨關節炎疾病的治療是研究的熱點之一。本實驗探討VEGF 對軟骨細胞凋亡，以及對增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的影響，為今后以VEGF 為靶點治療骨關節炎提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

武漢大學醫學部實驗動物中心提供的出生1 周齡的SD 級乳鼠10 只，雌雄不分，體重（100±10）g。DMEM/F12 培養基（Gibco），胎牛血清（美國Hyclone公司），胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（美國Sigma 公司），細胞總蛋白提取試劑盒（武漢谷歌生物），PCNA 一抗，Annexin-FITC 細胞凋亡試劑盒，NO 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 軟骨細胞的體外培養和分離 將乳鼠處死后，75%乙醇浸泡，取其膝關節軟骨，并無菌條件下移至加有10%胎牛血清的培養基中， 剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶37℃消化40 min，1000 r/min離心5 min 后，棄上清，用PBS 洗3 遍，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃消化2 h，細胞接種于DMEM/F12 培養基， 并補充100 mL/L 胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素， 密度為2×105接種于培養板，置于CO2培養箱中培養，待細胞70%～80%融合后，培養基中分別加入不同干預因素。實驗分三組，對照組：不加任何處理因素；VEGF 組：10 ng/mL VEGF；C 組：10 ng/mL IL-1β，每組設4 個復孔，連續培養48 h 進行檢測。

1.2.2 流式細胞技術檢測軟骨細胞凋亡 用0.25%胰酶將各組貼壁細胞從培養板上消化并分別收集至2 mL EP 管中，將各組細胞用1 mL PBS 洗滌一遍，最后各組分別加入5 μL Annexin-FITC、10 μL 碘化丙啶，室溫避光孵育15 min，上機檢測，重復5 次。

1.2.3 Western Blot 法檢測軟骨細胞PCNA 的表達6 孔板鋪軟骨細胞2×105孵育過夜， 加入以上干預因素，24 h 后，加入細胞裂解液100 μL 裂解細胞，按常規的Western Blot 操作方法進行，冰上裂解5 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清行BCA 蛋白定量；取樣品約10 μg 行SDS-PAGE 電泳， 將蛋白轉到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(兔抗PCNA單 克 隆 抗 體，1∶1000)，4℃過 夜；PBS 漂 洗3 次每次10 min，加入HRP 標記羊抗兔二抗(1∶3000)，室溫孵育1 h，漂洗3 次，用ECL 顯色液曝光，灰度掃描儀進行定量分析。

1.2.4 硝酸還原酶法檢測軟骨細胞分泌NO 的含量NO 是一種廣泛存在于生物體內的小分子物質， 是一種自由基，NO 在體內代謝很快轉變為NO2-和NO3-，而NO2-又將很快轉變為NO3-， 本法利用硝酸還原酶的特性將NO3-還原為NO2-來檢測NO 的含量。根據南京建成公司提供的硝酸還原酶檢測試劑盒，通過測定550 nm 處的吸光光度值，對各組細胞上清液中NO 的含量進行檢測。NO（μmol/L）=（測定管吸光度值－空白管吸光度值/標準管吸光度－空白管吸光度值）×標準品濃度（100 μmol/L）×樣品測試前稀釋倍數

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 16.0 對數據進行分析， 正態分布計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測軟骨細胞凋亡情況

對照組軟骨細胞凋亡率[（2.83±0.77）%]明顯低于VEGF 組[（9.28±2.35）%]和IL-1β 組[（17.14±5.07）%]，三組差異有高度統計學意義 （F = 56.145，P ＜0.01）。進一步組間比較，VEGF 組和IL-1β 組分別與對照組比較，VEGF 組與IL-1β 組比較，差異均有高度統計學意義（P ＜0.01），顯示IL-1β 與VEGF 具有促進軟骨細胞凋亡的作用，IL-1β 促凋亡作用更明顯。 見圖1。

圖1 各組流式細胞技術檢測軟骨細胞凋亡結果

2.2 軟骨細胞PCNA 蛋白的表達

對照組軟骨細胞PCNA 蛋白表達[（1.01±0.11）]明顯高于VEGF 組[（0.86±0.24）]及IL-1β 組[（0.72±0.05）]，三組間差異有高度統計學意義（F=91.99，P ＜0.01）。進一步組間比較，VEGF 組與對照組比較，IL-1β 組與對照組比較，差異均有高度統計學意義（P ＜0.01），VEGF組與IL-1β 組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 各組β-actin 以及PCNA 蛋白Western Blot 結果

2.3 NO 含量的檢測

軟骨細胞上清液中NO 含量VEGF 組[（112.31±12.73）μmol/L]和IL-1β 處理組[（150.02±15.34）μmol/L]明顯高于對照組[（49.35±6.68）μmol/L]，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。 進一步組間比較，VEGF 組與對照組比較，IL-1β 組與對照組比較，VEGF 組和IL-1β組比較，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。

3 討論

研究認為OA 軟骨退變與細胞因子、 基質降解酶、細胞凋亡等密切相關。 IL-1β 被認為是介導關節軟骨破壞最直接的細胞因子。 IL-1β 可以通過上調誘導型一氧化氮合酶和環氧化酶-2 的表達，誘導NO 和前列腺素E2的產生， 而NO 和前列腺素E2均是促進分解的重要因子。 IL-1β 能夠刺激軟骨細胞分泌基質金屬蛋白酶（metalloproteinases，MMPs），加速軟骨基質中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的降解，進而破壞軟骨細胞外基質的完整性及組織的內穩態。本研究用IL-1β 誘導軟骨細胞以模擬OA 軟骨細胞病理學改變，結果顯示，與對照組組比較，IL-1β 能刺激軟骨細胞，產生大量NO，IL-1β 處理組軟骨細胞凋亡率較正常組明顯增高（P ＜0.01），顯示用IL-1β 誘導的軟骨細胞符合OA 體外研究模型， 能夠模擬OA 體外軟骨細胞的病理學特點[1]。

VEGF 是血管生成的重要介質，研究發現，血管發生參與了OA 的發病機制， 血管發生與OA 滑膜炎、軟骨丟失、軟骨下骨重塑和骨贅形成密切相關。在眾多影響血管發生的因子中VEGF 的作用最為重要。關節軟骨細胞表達VEGF 數量增多，導致微小血管從軟骨下骨向軟骨不斷長入。微小血管釋放的促凋亡因子可以引起肥大層軟骨細胞的凋亡。骨關節炎患者的關節軟骨組織中促血管生成因子（如VEGF）的數量明顯增加，而抗血管生成因子的數量明顯減少，軟骨組織血管生成因子和促血管生成因子的平衡被破壞，結果導致血管從軟骨下骨長入到關節軟骨中，在軟骨內成骨中扮演重要角色，從而進一步加劇了骨關節炎的發展[2]。 此外，VEGF 在OA 軟骨組織中的表達明顯增高[3]。OA 患者的關節軟骨組織表達VEGF 的細胞數量明顯多于健康對照組[4]。 在OA 模型中發現類似血管翳樣組織，彩色多普勒發現OA 關節軟骨上的血管翳和組織學觀察到的血管增生一致[5]。 VEGF 能夠促進MMPs 的分泌，減少基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）的產生，從而改變了MMPs/TIMPs 的平衡， 促進軟骨基質降解[6-7]。 Ludin 等[8]發現膝關節腔注射VEGF 能夠引起關節軟骨退變，導致OA 的發生，認為VEGF 是OA 的重要致病因素。 VEGF 拮抗劑sFlt-1 治療骨關節炎組軟骨細胞凋亡降低， 軟骨細胞增殖水平增加， 提示VEGF 能夠介導膝關節骨關節炎軟骨細胞凋亡，抑制軟骨細胞增殖，VEGF 對關節軟骨細胞代謝的調節有重要作用[9]。 VEGF 參與了OA 的病理改變過程，在其發病過程中發揮重要作用， 以VEGF 為靶點成為OA的治療策略之一[10]。

細胞的凋亡，即程序性的死亡，對于細胞正常的生長和更新以及受損傷細胞的移除是十分重要的。正常軟骨細胞凋亡發生率較低，骨關節炎關節軟骨中有過度的軟骨細胞凋亡，凋亡可發生于軟骨全層，在OA模型中，可以觀察到軟骨細胞的凋亡較正常組明顯增多[1,11]，而軟骨細胞的凋亡是導致OA 軟骨細胞減少的主要原因。 OA 患者關節軟骨細胞中有典型的細胞凋亡，而且細胞凋亡的數量與OA 分級明顯相關，軟骨細胞的凋亡與OA 的進展密切相關。 軟骨細胞凋亡的機制目前仍不完全清楚。 研究發現NO 是一種重要的誘導軟骨細胞凋亡的因子，在OA 的發病機制中起到非常重要的作用[12]。NO 合成酶可以介導軟骨細胞產生大量NO，NO 能夠導致軟骨細胞凋亡的數量明顯增加。 OA 軟骨細胞凋亡數量與亞硝酸鹽產生的水平、OA分級呈明顯相關性。NO 的產生能夠誘導軟骨細胞的凋亡，軟骨細胞受到損傷后，抑制NO 的產生可能阻止骨關節炎早期病程的進展，表明NO 可誘發軟骨細胞凋亡[13]。 本研究結果顯示，IL-1β 處理組和VEGF 處理組軟骨細胞的凋亡率較正常組明顯增高，顯示IL-1β和VEGF 對軟骨細胞均有促凋亡作用，IL-1β 的作用更強。同時發現VEGF 和IL-1β 干預的軟骨細胞分泌的NO 含量明顯高于正常組，提示VEGF 和IL-1β 可能通過增加NO 介導軟骨細胞凋亡。

PCNA 是一種分子量為36000， 在細胞周期中參與DNA 復制的蛋白質。 它是DNA 聚合酶的輔助因子，在S 期參與DNA 的復制，并作為細胞增殖狀態的重要標志物。本研究結果發現VEGF 組和IL-1β 組中的PCNA 蛋白表達量均低于正常組， 說明VEGF 和IL-1β 有降低軟骨細胞的增殖活性的作用。

綜上述，本研究結果顯示VEGF 能夠介導關節軟骨細胞凋亡， 抑制軟骨細胞的增殖活性，VEGF 可能通過增加NO 介導軟骨細胞凋亡。

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