喉咽癌組織中Dickkopf—1的表達及意義 岳文慧 于鐵莉

張宇麗+陸鴻略++++梁媛+++++畢靜+++++齊智偉++++++張淑君

[摘要] 目的 探討Dickkopf-1在喉咽癌組織中的表達及其與各臨床病理因素的關系。 方法 選擇2008年1月～2013年12月來源于承德醫學院附屬醫院的30例喉咽癌組織和10例喉咽部正常黏膜組織，采用免疫組化SP法檢測中組織的Dickkopf-1的表達情況。 結果 ①Dickkopf-1在喉咽癌組織中的陽性表達率（36.67%），明顯低于喉咽部正常黏膜組織（80.00%），差異有統計學意義（P < 0.05）。②Dickkopf-1在喉咽癌組織中的表達與淋巴結轉移、臨床分期、病理分級、臨床分型、年齡和腫瘤大小無關（P > 0.05）。 結論 Dickkopf-1在喉咽癌組織中低表達可能與喉咽癌發生有關。

[關鍵詞] 喉咽癌；Dickkopf-1；免疫組化

[中圖分類號] R739.65 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（a）-0019-04

喉咽癌亦稱下咽癌，在國外其發病率約占每年新發頭頸部惡性腫瘤的5%，占全身惡性腫瘤的0.3%；在國內其發病率約占每年新發頭頸部惡性腫瘤的1.4%，占全身惡性腫瘤的0.2%[1]。絕大多數為鱗狀細胞癌，男性多發，最常見部位是梨狀窩，女性的喉咽癌多發生在環后區。雖然喉咽癌發病率較其他頭頸部惡性腫瘤相對較低，但是由于其發生位置隱蔽，相對臨床癥狀出現較晚，患者就診時多已經處于晚期。喉咽部有豐富的區域淋巴管，因此發現時往往伴有廣泛的區域淋巴結轉移。喉咽癌生物學性質惡劣，組織分化差，預后不良，喉咽癌已成為頭頸部惡性腫瘤中治療效果最差的腫瘤之一。盡管過去的幾十年里，喉咽癌的治療模式發生了重大變化，包括外科手術、放療和化療等多學科綜合治療變得極為重要。但總的5年生存率仍為25%～40%，基礎和臨床研究均在努力尋求新的治療方案來最大限度的提高生存率和降低喉咽癌的發病率。在目前已知的多種高發性惡性腫瘤中Wnt信號傳導途徑的失調與腫瘤的發生、發展密切相關，其通過調控下游靶基因的表達，進而來影響細胞凋亡、遷移和侵襲。作為Wnt通路的抑制因子，Dickkopf-1（DKK-1）蛋白是近年來發現的Dickkopfs（DKKs）家族成員之一。大量研究發現，Dickkopf-1蛋白通過經典Wnt/β-連環蛋白信號傳導途徑以及非經典Wnt信號傳導途徑在多種腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用，是當今腫瘤分子生物學的研究熱點。本研究應用免疫組織化學技術檢測喉咽癌和喉咽部正常黏膜組織中Dickkopf-1的表達情況，并分析Dickkopf-1表達與各臨床病理因素之間關系，試圖為探討喉咽癌的發生、發展提供一定的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇2008年1月～2013年12月承德醫學院附屬醫院（以下簡稱“我院”）耳鼻咽喉科住院手術治療的30例喉咽癌患者手術切除的癌組織，經術后病理證實所切除喉咽部腫瘤組織均為鱗狀細胞癌；患者均為男性，年齡為39～71歲，中位年齡56歲；術前均未接受放療、化療及免疫治療；有淋巴結轉移（根據術后病理決定有無淋巴結轉移）24例，無淋巴結轉移6例；臨床分期采用1997年UICC TNM分類分期標準，Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期26例；高分化4例，中分化17例，低分化9例；臨床分型：梨狀窩癌18例，喉咽后壁癌12例；腫瘤直徑<3 cm 10例，≥3 cm 20例。另外選擇我院耳鼻咽喉科同期手術切除非喉咽癌患者的喉咽部正常黏膜組織10例作為對照，均經術后病理證實；其中男9例，女1例；年齡31～65歲，中位年齡51歲。本研究經醫院倫理委員會批準通過，全部患者及家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 所取新鮮組織均在離體后立即放入10%中性甲醛中固定，經常規石蠟包埋后制成5 μm厚組織切片備用。

1.2.2 主要試劑 由美國Santa Cruz公司提供的Dickkopf-1兔抗人多克隆抗體（sc-25516）；由北京四正柏生物科技有限公司提供的即用型DAB顯色試劑盒；SP試劑盒是由福州邁新生物技術有限公司提供的即用型快捷免疫組化Max Vision試劑盒。

1.2.3 實驗方法 采用免疫組織化學（SP）法，按照實驗說明書嚴格進行各實驗步驟：石蠟標本常規5 μm連續切片，電熱恒溫箱80℃烤箱50 min，切片浸入二甲苯常規脫蠟，梯度酒精水化，3%H2O2室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS浸泡5 min。微波爐加熱0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）至沸騰后將上述組織切片放入，抗原熱修復15 min，室溫冷卻40 min，PBS沖洗，滴加一抗，4℃冰箱過夜。PBS沖洗，滴加二抗，濕室內孵育15 min。PBS沖洗，DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗，終止顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，鏡檢。一抗稀釋比例為1∶100，以PBS代替一抗做陰性對照，以美國Santa Cruz公司提供的陽性對照片做陽性對照。

1.2.4 判定結果 采用Volm雙評分法分別由3名經驗豐富的病理科醫生在光鏡200倍下隨機選擇5個染色均勻視野進行觀察，根據其評分的平均值判定結果：①按染色強度進行評分：無顯色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細胞百分率進行評分：陽性細胞百分率≤25%為1分，陽性細胞百分率26%～50%為2分，陽性細胞百分率>50%為3分。最后將以上兩項得分結果相加：0～2分判定為“+”，3～4分判定為“++”，5～6分判定為“+++”。“+”為陰性表達，“++”和“+++”為陽性表達。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉咽癌組織及喉咽部正常黏膜組織中的Dickkopf-1蛋白的表達情況

Dickkopf-1蛋白陽性表達呈棕黃色著色，陽性染色定位于細胞漿。Dickkopf-1在喉咽癌組織及正常喉咽部黏膜組織中均有表達，在喉咽癌組織中的陽性表達率明顯低于喉咽部正常黏膜組織，差異有統計學意義（χ2 = 4.0434，P = 0.0443）。見圖1～2（封三）、表1。

2.2 喉咽癌臨床病理因素與Dickkopf-1蛋白表達的關系

Dickkopf-1蛋白在喉癌組織中的表達與淋巴結轉移、臨床分期、病理分級、臨床分型、腫瘤大小、吸煙量和年齡無關（P > 0.05）。見表2。

3 討論

Dickkopf-1為一種分泌型糖蛋白，Glinka等[2]于1998年在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細胞內首次發現Dickkopf-1蛋白，是一種有力的Wnt信號通路拮抗劑，在胚胎頭頸形成期起重要作用。有學者在2000年發現，人Dickkopf-1基因位于10 號染色體10q11上。進一步研究表明，β-catenin可調控其下游靶基因Dickkopf-1的作用，可能與Wnt信號通路的負反饋調節有關[3-4]。學者首次在人HEK239T 細胞中提取出Dickkopf-1，其分子量約為45 kU，隨著研究的不斷深入，更多學者研究發現從不同細胞中提取出的Dickkopf-1的分子量存在一定差異，35～45 kU不等[5-6]。Dickkopf-1蛋白擁有255～350個氨基酸殘基，通過cDNA編碼，靠近N端的Cys-1和靠近C端的Cys-2為兩個富含半胱氨酸的保守區域。靠近C端的Cys-2是由10個半胱氨酸殘基構成，在全部Dickkopfs家族成員Dickkopf-1～4中均呈高度保守狀態，在抑制經典Wnt信號傳導通路過程中發揮決定性作用[7-8]。目前已知的Dickkopf-1受體有兩種：一種是低密度脂蛋白受體（LRP-5/6）；另一種是kremen蛋白受體。Dickkopf-1通過競爭結合LRP5/6蛋白受體直接抑制Wnt蛋白的活性，或通過Kremen蛋白受體間接與LRP5/6蛋白受體結合，導致細胞膜表面LRP5/6蛋白受體水平明顯下降，從而抑制Wnt蛋白向細胞內傳導信號，阻斷Wnt信號傳導途徑[9]。Dickkopf-1蛋白在不同腫瘤細胞中的表達情況及意義各有不同，但在喉咽癌中是否表達及其意義，尚未見相關報道。

本研究發現在喉咽癌組織中Dickkopf-1的陽性表達率明顯低于喉咽部正常黏膜組織中的陽性表達率Dickkopf-1，差異有統計學意義，提示Dickkopf-1蛋白表達可能與喉咽癌的發生有關。這與很多學者的實驗研究結果是一致的，在多種惡性腫瘤組織中Dickkopf-1表達下調。崔素芬等[10]對36例宮頸癌組織標本進行Dickkopf-1陽性表達檢測，結果顯示Dickkopf-1陽性表達呈現明顯下調。伊諾等[11]檢測并比較Dickkopf-1在子宮內膜癌及正常子宮內膜組織中的表達情況，結果顯示子宮內膜癌組織中Dickkopf-1表達明顯低于正常子宮內膜組織。Mikheev等[12]研究發現，外源性注入Dickkopf-1后宮頸癌Hela 細胞池中的Hela 細胞生長速度明顯減慢，而大劑量外源性注入Dickkopf-1有助于誘導宮頸癌細胞的凋亡。有異常甲基化出現于Hela細胞內的Dickkopf-1基因啟動子區，可能與組蛋白降解有關[13]。Licchesi等[14]研究表明，在進展中的肺腺癌中，Dickkopf-1啟動子區域的甲基化導致Dickkopf-1的低表達。仵正等[15]研究發現，Dickkopf-1在胰腺癌細胞中低表達，MSP分析發現約40%的Dickkopf-1在胰腺癌細胞中表達為甲基化。然而應用去甲基化調節劑處理后Dickkopf-1基因的表達明顯上調。Yamaguchi等[16]及陳恒君等[17]分別通過實驗研究發現，Dickkopf-1抑制惡性黑色素瘤的生長及其功能是通過抑制β-catenin來發揮作用，對惡性黑色素瘤細胞的增殖及功能調控有著至關重要的作用。喬玲等[18]經研究發現間充質干細胞BMMS-03通過釋放Dickkopf-1，進而抑制Wnt/β-catenin信號途徑，對乳腺癌MCF-7細胞的惡性表型具有明顯抑制作用。

Kenji等[19]研究發現，Dickkopf-1在無淋巴結轉移的口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的表達明顯高于有淋巴結轉移者，提示Dickkopf-1參與腫瘤細胞的轉移和侵襲。侯安麗等[20]研究結果顯示宮頸鱗狀細胞癌分化程度越差，Dickkopf-1的表達也越低，有淋巴結轉移者表達明顯低于無淋巴結轉移者，臨床分期越晚，Dickkopf-1的表達也明顯降低。Naoki等[21]研究結果表明，Dickkopf-1在頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）組織中表達下調，作為抑癌基因在腫瘤的發生、侵襲和轉移過程中充當重要角色，與腫瘤預后相關。而本研究結果顯示，在喉咽癌組織中Dickkopf-1的表達與淋巴結轉移、臨床分期、病理分型、臨床分型、腫瘤大小、吸煙量和年齡無關?？紤]與本實驗樣本量較小有關，增大樣本量后進一步實驗研究，預期發現其在喉咽癌腫瘤細胞侵襲及轉移中的作用。

Dickkopf-1作為Wnt信號傳導途徑抑制分子，與喉咽癌發生有關，預期成為喉咽癌治療及預防的新靶點，具體作用機制，有待進一步研究。

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（收稿日期：2014-08-16 本文編輯：蘇 暢）

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（收稿日期：2014-08-16 本文編輯：蘇 暢）