黃芪多糖對2型糖尿病患者外周血內皮祖細胞數量和功能的影響

劉 毅 李志樑 江騰春 傅 強

1.廣州市從化區中醫醫院內一科，廣東廣州 510900；2.南方醫科大學附屬珠江醫院心血管內科，廣東廣州 510280

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由多種致病因素作用于機體導致胰島功能減退和胰島素抵抗等引起的一種代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖和糖尿為主要特征，典型DM 患者可出現多飲、多尿以及消瘦等癥狀。 DM 的慢性并發癥不僅嚴重影響了患者的生活質量，更是導致其傷殘、死亡的主要原因。已有相關研究報道DM 并發癥的病理生理學改變主要是源自微血管病變和大血管病變，并且血管內皮損傷是DM 血管病變的始動環節和病理生理基礎[1]。 黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是中藥黃芪中的主要活性成分，既往體外實驗[2-3]揭示其具有促進血管內皮祖細胞增殖以及改善內皮功能等作用，從而可能有效干預DM 血管內皮損傷的發病過程。本研究是通過短期內給予2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者足療程APS 治療， 從而探討APS 對T2DM 患者外周血內皮祖細胞 （circulating endothelial progenitor cells，cEPCs）數量及功能的影響。 旨在為APS 在DM慢性并發癥的臨床治療中提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象的選擇及排除標準 選擇2013 年10月～2014 年5 月間在廣州市從化區中醫醫院內一科住院治療且確診為T2DM 的患者69 例，分為APS 治療組（36 例）和常規治療組（33 例）。 T2DM 診斷參照1999年WHO 診斷標準。 排除標準：高血壓、糖尿病等慢性疾病控制不佳；合并糖尿病并發癥；合并結締組織疾病、心血管系統疾病等影響EPCs 的因素；既往有他汀類藥物降脂治療史；炎癥、近期外傷、手術史；對黃芪多糖皮試陽性。 本實驗均征得患者本人書面同意。 所有研究過程均經醫院倫理委員會審查通過。

1.1.2 藥物干預 APS 治療組在普通西藥降糖治療的基礎上，每日通過靜脈滴注途徑加用注射用APS（商品名：伯恩，國藥準字220040086，天津賽諾制藥有限公司）250 mg，療程為2 周；常規治療組僅給予常規西藥降糖治療。 為防止受試患者因既往使用APS 對研究結果產生影響，需確保所有入選受試者在參與研究前1 個月內均無使用APS 治療。

1.2 材料與試劑

本研究全部實驗依托于南方醫科大學珠江醫院心血管實驗室完成。 實驗所需材料及試劑包括：人纖維連接蛋白（human fibronectin protein，HFN），購自美國BD 公司；Transwell 小室， 購自美國康寧公司；Dil標記乙酰化低密度脂蛋白（Dil-AcLDL），購自美國Invitrogen 公司；胎牛血清，購自美國Gibco 公司；EGM-2MV 培養基，購自瑞士LONZA 公司；二苯基四氮唑溴鹽 （MTT） 以及FITC 標記荊豆凝集素Ⅰ （FITCUEA-Ⅰ），均購自美國SIGMA 公司；單個核細胞分離液，購自天津灝洋生物制品公司；Hanks 平衡鹽溶液，購自北京索萊寶科技公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素，均購自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.3 方法

1.3.1 EPCs 的分離與培養 對入選參與研究的病例均于清晨空腹狀態下采集外周血10 mL，肝素抗凝后加入Hanks 平衡鹽溶液1∶1 混勻，沿試管壁緩慢加入20 mL 單個核細胞分離液，使用水平離心機（德國Eppendorf 公司） 以2000 r/min 離心20 min 后獲取所需要的單個核細胞并使用PBS 洗滌2 次， 經調整細胞懸液濃度后， 將單個核細胞接種于包被有HFN 的培養板上，加入EGM-2MV 培養基（含20%胎牛血清以及青霉素、鏈霉素各100 U/mL）培養EPCs。

1.3.2 EPCs 的鑒定 換液培養至第7 天，使用PBS 洗掉非貼壁細胞后，將細胞爬片與Dil-AcLDL（24 μg/mL）于37℃條件下孵育1 h， 用倒置熒光顯微鏡 （日本Olympus 公司）觀察EPCs 對Dil-AcLDL 的攝取。確定染色效果后用2%多聚甲醛固定細胞10 min，固定后用PBS 浸洗，加入FITC-UEA-Ⅰ（10 μg/mL）繼續于37℃條件下孵育1 h。 通過共聚焦顯微鏡（LSCM，德國Zeiss 公司）鑒定Dil-AcLDL 和FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽性細胞即為正在分化的EPCs。 采用倒置熒光顯微鏡對隨機選擇的5 個視野進行EPCs 計數。

1.3.3 EPCs 黏附功能檢測 使用0.25%的胰酶消化收集培養的貼壁細胞， 用EGM-2MV 培養液吹打均勻，計數并調節細胞濃度。 將等量EPCs 接種于包被有HFN 的培養板上，于細胞培養箱中繼續培養30 min，然后隨機選取3 個顯微鏡視野計數貼壁細胞。

1.3.4 EPCs 遷移功能檢測 收集貼壁EPCs 用于制備細胞懸液，將Transwell 小室（上室與下室間以8.0 μm孔徑的硝酸纖維膜分離開） 每下室分別加入600 μL的EGM-2MV 培養液， 并將100 μL 的EPCs 細胞懸液加入上室。將加入EPCs 的Transwell 小室放入細胞培養箱中孵育24 h。取出Transwell 小室，經PBS 清洗后，用棉簽去除微孔膜上層的細胞。用4%多聚甲醛固定已侵入并貼附于微孔膜下層的細胞，Giemsa 染色后隨機選擇3 個顯微鏡視野進行計數， 用于評價EPCs 的遷移能力。

1.3.5 EPCs 增殖功能檢測 采用MTT 法檢測EPCs增殖能力。首先制備細胞懸液并計數，將等量的EPCs懸液接種于96 孔板培養， 每孔100 μL 并加入MTT（5 g/L）20 μL，于細胞培養箱培養4 h。 之后取出棄上清液，向每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，于微量振蕩器振蕩10 min 使結晶物充分溶解， 然后置全自動酶標儀于波長490 nm 處測定各孔吸收OD 值，用于評價EPCs 增殖能力。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析， 計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPCs 的鑒定

由分離獲取的單個核細胞培養7 d 后在顯微鏡下觀察細胞呈梭型。 通過共聚焦顯微鏡鑒定Dil-AcLDL（紅色，激發波長為543 nm）和FITC-UEA-Ⅰ（綠色，激發波長為477 nm）雙染色陽性（呈黃色）細胞即為正在分化的EPCs（圖1，見封三），于倒置熒光顯微鏡下隨機選擇5 個視野（倒置熒光顯微鏡，200×）進行計數并比較。

2.2 APS 對T2DM 患者cEPCs 數量及黏附功能、遷移功能、增殖功能的影響

兩組患者在治療前cEPCs 的數量及功能差異均無統計學意義（P ＞0.05）；常規治療組在治療前后cEPCs的數量及功能無明顯改變（P ＞0.05）；APS 治療組患者經過為期2 周的療程后，cEPCs 的數量顯著增加且cEPCs 各功能均明顯改善，與治療前及常規治療組治療后比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 治療前后兩組cEPCs 數量及黏附功能、遷移功能、增殖功能比較（）

表1 治療前后兩組cEPCs 數量及黏附功能、遷移功能、增殖功能比較（）

注： 與本組治療前比較，*P ＜0.05； 與常規治療組治療后比較，#P ＜0.05；APS：黃芪多糖；cEPCs：外周血內皮祖細胞

組別cEPCs 數量（個/HP）黏附細胞（個/HP）遷移細胞（個/HP） 增殖功能APS 治療組（n=36）治療前治療后常規治療組（n=33）治療前治療后35.16±9.23 46.63±9.22*#17.33±7.52 23.28±8.43*#10.36±9.23 15.96±9.56*#0.323±0.082 0.486±0.085*#34.78±8.09 37.56±9.82 16.98±9.12 18.21±10.79 10.01±7.67 10.43±10.38 0.319±0.073 0.339±0.097

2.3 不良反應

兩組患者在研究進行過程中，均未有嚴重不良反應。個別患者使用后出現皮膚紅斑、瘙癢、蕁麻疹等過敏反應，但短期內均可自行消失。

圖1 培養7 d 后EPCs（倒置熒光顯微鏡，200×）

3 討論

近年來T2DM 的發病率呈逐年增高趨勢，DM 作為一種嚴重危害人體健康的慢性疾病，已成為世界性公共問題， 其血管病變導致的并發癥不僅嚴重影響DM 患者生活質量， 并且是DM 患者致死致殘的主要原因。 有相關報道表明約70%的T2DM 患者死于DM血管并發癥。 EPCs 是一類能增殖并分化為成熟血管內皮細胞的前體細胞， 可增加缺血組織新生血管形成，并能夠促進損傷內膜的再內皮化，在修復受損內皮并維持正常的內皮功能方面起著極為重要的作用。目前已有研究揭示血管內皮損傷是DM 血管病變的重要始動環節[1]。 而DM 損傷內皮功能的主要病理生理學機制是高血糖及其氧化代謝產物抑制血管內皮NO 生成[4]，抑 制EPCs 分 化 并 促 其 凋 亡[5]，EPCs 受 損后釋放大量炎癥因子介導血管內膜的炎性反應[6]。

黃芪是由豆科植物蒙古黃芪及膜夾黃芪的干燥塊莖入藥，其味甘，性微溫，歸肺脾二經，中醫治療上具有補氣升陽、益衛固表、利尿脫毒以及斂瘡生肌等功效。 作為一味藥用歷史悠久的傳統補益類中藥，目前臨床上常用于糖尿病、冠心病等慢性疾病的中醫輔助用藥。APS 是從中藥黃芪中分離提取出來的一種大分子化合物，具有較強的生物活性，是黃芪的主要活性成分之一，具有降低血脂、抗動脈粥樣硬化以及調控血糖等作用[7-9]。 有相關動物研究揭示APS 可改善DM 的物質代謝以及延緩DM 慢性并發癥的病程[10]。

徐寒松等[11]在體外實驗中證實，一定濃度范圍內APS 對DM 患者EPCs 的增殖具有促進作用， 且與APS 劑量、使用時間呈依賴關系，其具體作用機制可能是通過PI3K/Akt/eNOS 信號途徑達成[12]。 同時APS能夠促使EPCs 分泌血管內皮生長因子[3]參與受損血管內皮再生。 提示APS 參與血管內皮損傷修復，并且可以促進EPCs 增殖及分化。

本研究通過對比APS 治療組在西藥降糖的基礎上短期加用足療程APS 治療及常規治療組的單純降糖對癥治療在T2DM 患者中的作用。 研究結果證實，短期足療程APS 治療可以顯著增加T2DM 患者cEPCs 的數量，同時也能夠顯著改善其cEPCs 的黏附能力、遷移能力、增殖能力，與常規治療相比，差異具有統計學意義（P ＜0.05）。

綜上所述，血管內皮損傷在T2DM 合并血管病變的慢性并發癥中扮演著重要角色，而T2DM 患者短期足療程使用APS 治療可明顯增加其cEPCs 的數量且伴隨著cEPCs 功能的顯著改善， 為短期APS 治療在T2DM 患者慢性并發癥的應用上提供了初步依據。 但APS 改善DM 患者cEPCs 數量及功能的具體作用機制，仍有待于進一步的探討和研究。 同時由于本次研究的樣本量相對較少，尚需增加樣本量使研究結果更確切。

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