他莫昔芬對大鼠脊髓損傷后炎性反應及細胞凋亡的影響

韋竑宇 梁 立

中日友好醫(yī)院脊柱外科，北京 100029

他莫昔芬作為乳腺癌患者內(nèi)分泌治療藥物在臨床已被廣泛應用。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬在缺血缺氧性腦損傷、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）、腦出血等疾病中可發(fā)揮神經(jīng)保護作用[1-3]。但他莫昔芬在SCI 中發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制仍是未解之謎。

本研究旨在通過檢測核因子kappa B p65 （NFκB p65）及磷酸化核因子κB 抑制因子α（pI-κB α）表達，觀察他莫昔芬對核因子-kappa B 抑制蛋白激酶復合體/核因子kappa B（IKK/NF-κB）通路的調(diào)控；通過檢測活性半胱天冬酶-3（caspase-3）活化水平，觀察其對細胞凋亡的影響； 通過檢測髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，觀察其對炎癥細胞浸潤的影響，從而探討其神經(jīng)保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠51 只（由中日友好醫(yī)院實驗動物中心提供），鼠齡10～12 周，體重200～220 g，隨機分為3 組：假手術(shù)組（n=17，僅行椎板切除術(shù)）； 對照組 （n=17，SCI+硬膜下注射二甲基亞砜）；他莫昔芬組（n=17，SCI+硬膜下注射他莫昔芬）。

1.2 模型制備及給藥

3 組大鼠麻醉后，假手術(shù)組僅行T11～T13段椎板切除。其余兩組以T12棘突為中心，咬除椎板，暴露脊髓，用質(zhì)量為20 g 的不銹鋼棒從12.5 mm 高處垂直落下（打擊量25 g·cm），誘發(fā)脊髓損傷。

SCI 后30 min，對照組硬膜下注射2%二甲基亞砜5 mL/kg； 他莫昔芬組損傷部位硬膜下注射他莫昔芬5 mg/kg（溶于2%二甲基亞砜1 mg/mL）。

術(shù)后24 h，3 組大鼠以10%水合氯醛（600 mg/kg）麻醉后， 以含有1 U/mL 肝素的生理鹽水進行心臟灌洗，截取10 mm 損傷節(jié)段脊髓，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫印跡法檢測NF-κB p65、pI-κB α 和活性caspase-3

蛋白提取按照蛋白抽提試劑盒說明書進行（普利萊基因有限公司， 北京），BCA 法蛋白定量檢測濃度（普利萊基因有限公司，北京），計算蛋白電泳加樣量。根據(jù)蛋白濃度進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉、4℃一抗過夜， 一抗分別為小鼠抗大鼠NF-κB p65 單克隆抗體（1∶1000，Santa Cruz 公司，美國）、兔抗大鼠pIκB α 單克隆抗體（1∶500，Cell Signalling 公司，美國）、兔抗大鼠活性caspase-3 單克隆抗體 （1∶1000，Cell Signalling 公司，美國）；洗膜，將標記辣根過氧化物酶的羊抗兔或羊抗小鼠二抗分別加入二抗稀釋液中（1∶2000，Jackson West Grove 公司，美國），37℃孵育1 h，漂洗二抗，ECL 法發(fā)光（ECL 試劑盒：普利萊基因有限公司，北京）。 X 線曝光10 s～1 min。 掃描膠片，運用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國） 進行灰度值分析， 以其光密度（Optical density，OD）表示。

1.4 比色法檢測MPO 活性

脊髓組織中MPO 活性檢測按照MPO 活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）說明書進行，在460 nm 處，1 cm 光徑，測各組OD 值，根據(jù)說明書中的計算公式，推算MPO 活性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行分析（SPSS 公司，美國），計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析和Bonferrni 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p65 的表達

免疫印跡法檢測各組脊髓組織NF-κB p65 的表達水平，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，對照組術(shù)后24 h NF-κB p65 的表達水平較高，他莫昔芬組NF-κB p65表達水平顯著低于對照組（P ＜0.05）。 見圖1、表1。

圖1 核因子kappa B p65 免疫印跡檢測結(jié)果

2.2 pI-κB α 的表達

采用免疫印跡檢測各組脊髓組織中pI-κB α 的表達水平，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，對照組pI-κB α顯著升高， 而他莫昔芬明顯抑制了pI-κB α 的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。 見圖2、表1。

圖2 磷酸化核因子κB 抑制因子α 免疫印跡檢測結(jié)果

2.3 活性caspase-3 的表達

本研究選擇活性caspase-3 作為細胞凋亡相關(guān)的指標進行檢測，結(jié)果顯示：脊髓損傷24 h 后，與假手術(shù)組相比，對照組活性caspase-3 表達水平明顯升高，他莫昔芬顯著降低了活性caspase-3 的表達， 差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見圖3、表1。

圖3 活性半胱天冬酶-3 免疫印跡檢測結(jié)果

表1 Western blot 結(jié)果定量分析（）

表1 Western blot 結(jié)果定量分析（）

注： 與假手術(shù)組比較，#P ＜0.05； 與對照組比較，*P ＜0.05；NF-κB p65：核因子kappa B p65；pI-κB α：磷酸化核因子κB 抑制因子α；caspase-3：活性半胱天冬酶-3

組別 只數(shù) NF-κB p65 pI-κB α caspase-3假手術(shù)組對照組他莫昔芬組17 17 17 0.31±0.03 3.17±0.12#1.55±0.07#*0.12±0.01 0.98±0.05#0.53±0.03#*0.08±0.01 1.03±0.05#0.36±0.02#*

2.4 MPO 活性

通過檢測脊髓組織中MPO 活性反映炎性細胞浸潤程度，結(jié)果顯示：假手術(shù)組中，MPO 活性極低，另外兩組則明顯升高， 其中對照組升高更為顯著 （P ＜0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后24 h 脊髓組織中髓過氧化物酶活性（U/mg，）

表2 各組大鼠術(shù)后24 h 脊髓組織中髓過氧化物酶活性（U/mg，）

注：與假手術(shù)組比較，#P ＜0.05；與對照組比較，*P ＜0.05；MPO：髓過氧化物酶

組別 只數(shù) MPO假手術(shù)組對照組他莫昔芬組17 17 17 0.06±0.01 0.64±0.03#0.35±0.02#*

3 討論

多個研究表明他莫昔芬可發(fā)揮神經(jīng)保護作用，據(jù)報道， 他莫昔芬能夠減輕腦出血部位周圍細胞水腫，減輕SCI 后組織水腫， 促進癱瘓肢體的運動功能恢復[4-6]；在缺血缺氧過程中參與氧自由基的清除，從而大大減少過氧硝酸鹽的生成[7-8]；同時可減弱小膠質(zhì)細胞及反應性星形膠質(zhì)細胞活化，發(fā)揮抗放射性腦損傷作用[9]。學者們發(fā)現(xiàn)，通過抑制炎性反應和神經(jīng)細胞凋亡可有效緩解脊髓損傷，促進神經(jīng)功能恢復[10-12]。本研究旨在觀察他莫昔芬對SCI 過程中炎性反應及細胞凋亡的影響，探討其神經(jīng)保護機制。

眾所周知， 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 家族是調(diào)控人體炎性反應的重要環(huán)節(jié)，有多條路徑可激活NF-κB，I-κB激酶復合體磷酸化I-κB（I-κB α、I-κB β、I-κB ε）介導的經(jīng)典路徑在固有免疫的啟動中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道， 對IKK/NF-κB 通路的成功干預可有效緩解SCI的病理過程[13]。NF-κB 并非是一種單一蛋白，而是NFκB/Rel 家族成員構(gòu)成各種二聚體的總稱。已知有5 種哺乳類Rel 蛋白：NF-κB1 （p50 及其前體p105）、NFκB2（p52 及其前體p100）、c-Rel、RelA（p65）和RelB。 由p65：p50 構(gòu)成的異二聚體是絕大多數(shù)細胞最為常見的NF-κB 形式，而且，僅RelA（p65）和c-Rel 具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種藥物通過影響NF-κB通路及其基因產(chǎn)物在體外發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14-17]。 本研究選取p65 和pI-κB α 作為代表IKK/NF-κB 通路活化程度的指標進行檢測，結(jié)果顯示，他莫昔芬成功抑制了IKK/NF-κB 通路的傳導， 在兩組SCI 大鼠中檢測到pI-κB α 表達水平明顯高于假手術(shù)組，而他莫昔芬的應用降低了pI-κB α 的表達水平，同時使p65表達水平顯著降低。

SCI 發(fā)生后炎性反應緊隨其來，炎癥細胞開始釋放大量的促炎遞質(zhì)及神經(jīng)毒性物質(zhì)，如活性氧自由基ROS 和活性氮自由基RNS，加重脂質(zhì)過氧化，損害神經(jīng)元，從而加重神經(jīng)功能障礙[18]。 在所有炎癥細胞中，中性粒細胞是最快到達損傷部位的。 MPO 是主要存在中性粒細胞嗜天青顆粒中的一種酶，可催化過氧化氫和氯陰離子反應生成次氯酸和氯胺類，其活性的高低反映中性粒細胞的浸潤程度、數(shù)量及活性，從而反映出炎癥的嚴重程度， 為判定脊髓損傷程度提供依據(jù)[19]。 本實驗結(jié)果表明在SCI 組MPO 表達顯著升高，而應用他莫昔芬可大大降低損傷脊髓組織內(nèi)MPO 的表達水平，下調(diào)了炎性反應的程度。

SCI 中的另一關(guān)鍵病理過程是凋亡，Crowe 等[20]研究表明，在大鼠SCI 模型脊髓白質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)大量凋亡細胞。凋亡所致的軸突變性及白質(zhì)纖維脫髓鞘可最終引發(fā)神經(jīng)元功能損傷[21-23]。 細胞凋亡轉(zhuǎn)錄啟動最重要的因子為caspase-3 蛋白酶[24]，它的激活是觸發(fā)細胞凋亡的關(guān)鍵，被稱為“分子開關(guān)”[25]。因此，caspase-3 的活性可反映損傷部位細胞凋亡的發(fā)生程度。本研究發(fā)現(xiàn)，損傷24 h 后，對照組的活性caspase-3 表達明顯升高， 損傷部位注射他莫昔芬可顯著降低caspase-3活性，表明他莫昔芬在脊髓損傷中具有抗凋亡特性。

綜上所述，本研究提示他莫昔芬成功降低NF-κB p65 和pI-κB α 的表達，從而抑制IKK/NF-κB 通路介導的炎性反應。 通過檢測組織中MPO 活性證實了他莫昔芬可減少脊髓損傷部位炎癥細胞浸潤， 此外，他莫昔芬可降低caspase-3 活性發(fā)揮抗細胞凋亡作用。

[1] Tian DS，Liu JL，Xie MJ，et al. Tamoxifen attenuates inflammatory -mediated damage and improves functional outcome after spinal cord injury in rats [J]. J Neurochem，2009，109（6）：1658-1667.

[2] Xie Q，Guan J，Wu G，et al.Tamoxifen treatment for intracerebral hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl，2011，11：271-275.

[3] Feng Y，F(xiàn)ratkins JD，LeBlanc MH. Treatment with tamoxifen reduces hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats [J]. Eur J Pharmacol，2004，484（1）：65-74.

[4] Kimelberg HK，F(xiàn)eustel PJ，Jin Y，et al. Acute treatment with tamoxifen reduces ischemic damage following middle cerebral artery occlusion [J]. Neuro Report，2000，11（12）：2675-2679.

[5] Kimelberg HK，Jin Y，Charniga C，et al. Neuroprotective activity of tamoxifen in permanent focal ischemia [J]. J Neurosurg，2003，99（1）：138-142.

[6] Rutledge EM，Aschner M，Kimelberg HK. Pharmacological characterization of swelling-induced D-[3H]aspartate release from primary astrocyte cultures[J].Am J Physiol，1998，274（6）：C1511-C1520.

[7] Wiseman H，Cannon M，Arnstein HR，et al.Tamoxifen inhibits lipid peroxidation in cardiac microsomes. Comparison with liver microsomes and potential relevance to the cardiovascular benefits associated with cancer prevention and treatment by tamoxifen [J]. Biochem Pharmacol，1993，45（9）：1851-1855.

[8] Osuka K，F(xiàn)eustel PJ，Mongin AA，et al. Tamoxifen inhibits nitrotyrosine formation after reversible middle cerebral artery occlusion in the rat [J]. J Neurochem，2001，76（6）：1842-1850.

[9] Liu JL，Tian DS，Li ZW，et al. Tamoxifen alleviates irradiation-induced brain injury by attenuating microglial inflammatory response in vitro and in vivo [J]. Brain Res，2010，1316：101-111.

[10] Kubota K，Saiwai H，Kumamaru H，et al. Myeloperoxidase exacerbates secondary injury by generating highly reactive oxygen species and mediating neutrophil recruitment in experimental spinal cord injury [J]. Spine，2012，37（16）：1363-1369.

[11] 韓曉光，田偉，劉波，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復的影響[J].中國脊柱脊髓雜志，2013，23（11）：998-1005.

[12] 劉亞東，陳學明，于振山，等.大鼠脊髓損傷后大腦運動皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的觀察[J].中國脊柱脊髓雜志，2013，23（6）：546-552.

[13] Lu M，Wang S，Han X，et al.Butein inhibits NF-κB activation and reduces infiltration of inflammatory cells and apoptosis after spinal cord injury in rats[J].Neurosci Lett，2013，542：87-91.

[14] Han X，Lu M，Wang S，et al. Targeting IKK/NF-kappa B pathway reduces infiltration of inflammatory cells and apoptosis after spinal cord injury in rats[J].Neurosci Lett，2012，511（1）：28-32.

[15] Pandey MK，Sandur SK，Sung B，et al. Butein，a tetrahydroxychalcone，inhibits nuclear factor （NF）-kappaB and NF-kappaB-regulated gene expression through direct inhibition of IkappaBalpha kinase beta on cysteine 179 residue [J]. J Biol Chem，2007，282（24）：17340-17350.

[16] Niederberger E，Geisslinger G. The IKK-NF-kappa B pathway： a source for novel molecular drug targets in pain therapy[J]. FASEB J，2008，22（10）：3432-3442.

[17] Huxford T，Huang DB，Malek S，et al. The crystal structure of the I kappaB alpha/NF-kappa B complex reveals mechanisms of NF-kappa B inactivation[J].Cell，1998，95（6）：759-770.

[18] Yune TY，Lee SM，Kim SJ，et al. Manganese superoxide dismutase induced by TNF-beta is regulated transcriptionally by NF-kappa B after spinal cord injury in rats [J]. J Neurtrauma，2004，21（12）： 1778-1794.

[19] 宋佳，齊慧慧，賈連順.原花青素對大鼠急性脊髓損傷的保護作用及機制研究[J].中國矯形外科雜志，2013，21（8）：794-798.

[20] Crowe MJ，Bresnahan JC，Shuman SL，et al. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rat sand monkeys [J]. Nat Med，1997，3（1）：73-76.

[21] Grossman SD，Rosenberg LJ，Wrathall JR. Temporal-spatial pattern of acute neuronal and glial loss after spinal cord contusion [J]. Exp Neurol，2001，168（2）：273-282.

[22] Hagg T，Oudega M. Degenerative and spontaneous regenerative processes after spinal cord injury[J]. J Neurotrauma，2006，23（3-4）：264-280.

[23] Jiang SC，Bendjelloul F，Ballerini IP，et al. Guanosine reduces apoptosis and inflammation associated with restoration of function in rats with acute spinal cord injury[J].Purinergic Signal，2007，3（4）：411-421.

[24] Brusselmans K，Vrolix R，Verhoeven G，et al. Induction of cancer cell apoptosis by flavonoids is associated with their ability to inhibit fatty acid synthase activity [J]. J Biol Chem，2005，280（7）：5636-5645.

[25] Patil CS，Singh VP，Satyanarayan PS，et al. Protective effect of flavonoids against aging-and lipopolysaccharideinduced cognitive impairment in mice [J]. Pharmacology，2003，69（2）：59-67.