二十碳五烯酸玻璃體注射治療糖尿病性視網膜病變的實驗研究

董白霞，葉存喜，包永琴，姚一民，魏玉華，楊 欣

（河北醫科大學第二醫院眼科，河北 石家莊 050000）

二十碳五烯酸玻璃體注射治療糖尿病性視網膜病變的實驗研究

董白霞，葉存喜，包永琴，姚一民，魏玉華，楊 欣

（河北醫科大學第二醫院眼科，河北 石家莊 050000）

目的 探討二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）治療糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是否有效。方法 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）聯合應用誘導產生增殖型糖尿病視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）動物模型24只。隨機分為D組（背景期給藥組）12只、E組（增殖前期給藥組）8只、F組（增殖期給藥組）4只，玻璃體注射EPA，應用眼底熒光血管造影（fluorescence fundus angiography，FFA）、CD105免疫組織化學光鏡觀察眼底病變及陽性血管內皮細胞的變化，并與前期建立的PDR動物模型進行比較。結果 FFA結果顯示，E組給藥后2周內效果最佳，而D組給藥后8周內均有效，隨時間延長藥效不斷增強；E組給藥后6周時效果差于D組給藥后2、4、8周時；與未用藥組相比，在相同的病程時均未觀察到視網膜新生血管。F組給藥后仍可觀察到視網膜新生血管形成，并且DR也沒有明顯減輕。CD 105免疫組織化學結果顯示，相同的病程內，D組和E組未觀察到CD 105陽性的視網膜血管內皮細胞，但F組仍觀察到CD 105陽性血管內皮細胞。結論 EPA可以在DR背景期和增殖前期封閉VEGF受體flk-1，阻斷DR的發展。

視網膜疾病；血管內皮生長因子類；熒光血管造影

目前尚缺乏安全、經濟、有效的藥物用于增殖性糖尿 病 性 視 網 膜 病 變 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）的治療。尋求此類藥物已成為眾多學者研究和關注的熱點問題。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是人體正常飲食中不可缺少的不飽和脂肪酸，Yang等［1］研究證實，EPA可抑制體外培養的牛頸動脈內皮細胞增殖。我們前期研究證明，EPA可抑制體外培養的人血管內皮細胞增殖［2］。但有人認為EPA對糖尿病視網膜病變有促進作用［3］。因此，本研究選用已建立的PDR模型［4］，根據體外實驗得出的有效 EPA濃度和劑量［2］，在糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）不同時期給予EPA治療，觀察EPA在不同時期給藥的治療效果，報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源、選擇及分組：選擇8周齡健康SD大鼠31只，雌雄各半，體質量180～250g，購自河北省實驗動物中心。31只鼠腹腔注射鏈脲佐菌素

（streptozotocin，STZ）（60mg／kg，用0.01mol／L的枸櫞酸鹽緩沖液溶解、濃度為 10g／L），1周后測血糖（美國強生血糖儀）≥13.9mmol／L確定為糖尿病鼠［5］，之后每周測血糖 1次，血糖＜13.9mmol／L鼠淘汰出糖尿病組，共注射31只，成模24只，成模率為77.4%。24只糖尿病大鼠采用隨機方法分為 3組。①D組（背景期給藥組）12只，注射STZ后1個月時846復合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內注射全麻后，雙眼玻璃體注射血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）0.5μL（美國Sigma公司）＋EPA 0.5μL（美國Cayman公司）＋生理鹽水1.0μL。②E組（增殖前期給藥組）8只，注射STZ后1個月時846復合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內注射全麻后，雙眼玻璃體注射VEGF 0.5μL＋生理鹽水1.5μL，2周后雙眼玻璃體液射EPA 0.5μL＋生理鹽水1.5μL。③F組（增殖期給藥組）4只，注射STZ后1個月時846復合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內注射全麻后，雙眼玻璃體注射VEGF 0.5μL＋生理鹽水1.5μL，4周后雙眼玻璃體注射EPA 0.5μL＋生理鹽水1.5μL。

1.2 實驗方法

1.2.1 眼底熒光血管造影（fluorescence fundus angiography，FFA）檢查：玻璃體注射VEGF后第2周（D1亞組）、4周（D2、E1亞組）、8周（D3亞、E2亞、F組）各選3只鼠846復合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內注射全麻后20%熒光素鈉0.1mL腹腔注射，行雙眼FFA檢查，觀察眼底病變程度。

1.2.2 視網膜組織病理學觀察：每組3只動物FFA后，左側頸動脈注射碳素墨汁后處死，摘除左眼球做組織切片，觀察其視網膜微血管對碳素顆粒的滲漏程度；摘除右眼球做組織切片，行CD105免疫組織化學染色，觀察有無增殖的新生血管內皮細胞。

2 結 果

2.1 FFA造影結果：D1組3只鼠FFA可見背景熒光增強，其中2只鼠可見視網膜出血（圖1）；D2組3只鼠均可見背景熒光增強，其中2只鼠出現視網膜大血管扭曲變形和毛細血管擴張，1只鼠出現了視網膜內出血（圖 2），未觀察到視網膜新生血管；D3組3只鼠可觀察到血管熒光素滲漏，無 1例觀察到視網膜新生血管。E1組中 1只可見到視網膜大血管扭曲和毛細血管擴張、滲漏，2只鼠觀察到背景熒光的增強；E2組3只鼠均可觀察到視網膜出血、無1例觀察到視網膜新生血管。F組3只鼠均觀察到背景熒光的增強和視網膜內出血（圖3，4），有 1只發現了視網膜新生血管（圖5）。

2.2 視網膜組織病理學觀察：光鏡觀察視網膜血管滲漏情況及免疫組織化學CD 105標記視網膜新生血管。D1組中2只鼠觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網膜切片CD 105免疫組織化學染色均為陰性。D2組中1只鼠可觀察到神經節細胞層大血管有碳素顆粒的滲漏；3只鼠視網膜切片CD105免疫組織化學染色均為陰性。D3組中均未觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網膜切片CD 105免疫組織化學染色均為陰性。E1組中1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網膜切片 CD 105免疫組織化學染色均為陰性。E2組，1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；3只鼠視網膜切片CD105免疫組織化學染色均為陰性。F組，3只鼠均觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏；1只鼠視網膜切片CD105免疫組織化學染色為陽性，觀察到視網膜前膜（圖6）。

3 討 論

隨著糖尿病患者數量在世界范圍內的與日俱增，DR已經成為生后最常見的致盲原因。90%以上的糖尿病患者最終會發生視網膜病變，其中 1型糖尿病患者中有60%、2型糖尿病患者中有20%會發展為PDR［6］。由于目前的治療方法——光凝和玻璃體切除術勢必會帶來損害并且只在短期內有效，考慮到糖尿病患者的數量近年來持續增加，探索新的治療方法迫在眉睫。

VEGF是造成DR新生血管形成的關鍵性因子，阻斷其作用理論上可以抑制DR的發生和發展。目前在脈絡膜新生血管性疾病的研究中已有3種藥物應用于臨床研究階段，即 Macugen、Lucentis、Avastin。上述3種藥物價格昂貴，均屬于VEGF抗體類藥物，可否用于治療視網膜的新生血管性疾病尚有爭議。

EPA作為VEGF受體 flk-1的封閉劑［7］，理論上可以達到阻斷DR的效果［8］；另外，它還是人體中所必須的一種不飽和脂肪酸，廣泛存在于深海魚油中，對生物體無毒、無不良反應，開發前景廣闊。近年來，EPA受到越來越多國外學者的關注。已有研究［1］表明，EPA在體內可以抑制腫瘤的生長和轉移，在體外對VEGF誘導的牛頸動脈內皮細胞增殖有抑制作用，故其在體內抑制腫瘤生長的機制之一有可能是選擇性抑制VEGF受體flk-1，從而抑制腫瘤的新生血管形成。我們的研究結果也表明，當EPA濃度達到0.15g／L時，可以抑制體外培養的人血管內皮細胞的增殖［2］。但對于EPA體內應用對DR的治療作用尚存在爭議［3］。因此，我們研究了EPA體內應用對DR的作用。

從本實驗FFA結果與前期研究［4］結果比較來看，D1組3只鼠（3／3）FFA可見背景熒光增強，其中2只鼠（2／3）可見視網膜出血，與前期研究中相同病程未治療組（C1組）發生視網膜出血的概率相同；D2組3只鼠均可見背景熒光增強，其中2只鼠（2／3）出現視網膜大血管扭曲變形和毛細血管擴張，1只鼠（1／3）出現了視網膜內出血，可見視網膜出血的發生率比C1、D1組的發生率降低了，而視網膜血管扭曲變形和毛細血管擴張這種比出血輕微的病變發生率增加了，說明DR的病情延緩了；未觀察到視網膜新生血管，說明EPA治療組在注射VEGF后4周仍未發生增殖性的病變。D3組3只鼠（3／3）可觀察到血管熒光素滲漏，但無1例觀察到視網膜新生血管，既無增殖性病變的發生，又較D1、D2組病變減輕。上述情況表明，背景期治療可以延緩背景期DR的病變進展，給藥后8周效果優于4周，4周時又優于2周，同時阻止了增殖性病變的發生。E1組1只鼠（1／3）可見到視網膜大血管扭曲和毛細血管擴張、滲漏，而無1例觀察到視網膜出血，說明E1組DR病變比D1組減輕；2只鼠（2／3）觀察到背景熒光的增強，較D1組發生率（3／3）降低；也就是說，增殖前期治療在給藥后2周內DR的病變程度較背景期治療組明顯減輕；D2組有 1例出血，E1組無1例出血，僅有1只鼠出現視網膜大血管扭曲和毛細血管擴張、滲漏；E1組2只鼠背景熒光增強，發生率低于D2組（3／3）。上述結果表明，增殖前期治療組注射VEGF后4周不僅沒有發生前期研究中相同病程未治療組（C2組）的新生血管，而且DR病變程度也輕于D2組（背景期治療組注射VEGF后4周）；E2組3只鼠均可觀察到視網膜出血（3／3），無 1例觀察到視網膜新生血管；雖未出現增殖性病變，但BDR病變的程度較D1、D2、D3、E1組重。說明增殖前期治療組在給藥后6周時的效果已明顯減退，差于同期給藥后 2周和背景期給藥后 2、4、8周的效果。由此可見，增殖前期治療組給藥后的 2周內EPA作用效果最明顯，而在背景期治療組給藥后8周內均有效，隨時間延長效果增強，分析原因可能是大鼠玻璃體為不液化玻璃體，藥物進入玻璃體后完全吸收所需時間長，故出現上述現象；而在增殖前期給藥組中，由于此階段VEGF水平高，需要足夠的藥物來封閉受體，所以同樣劑量的EPA被充分消耗，才會出現在給藥后6周時作用較差、但仍有效的結果。F組3只鼠（3／3）均觀察到背景熒光的增強和視網膜內出血，有1只（1／3）發現了視網膜新生血管。表明視網膜出血的發生率在F組增加，還有新生血管出現，說明增殖期治療組已有的PDR不能逆轉，非PDR的發展也無減輕，這種結果與EPA是VEGF受體封閉劑有關。

其次，從光鏡觀察視網膜血管滲漏情況及免疫組織化學CD 105標記視網膜新生血管的情況來看，D1組2只鼠觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏D2組1只鼠可觀察到神經節細胞層大血管碳素顆粒的滲漏，D3組均未觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏。說明隨給藥后時間的延長，DR病變程度在減輕，與FFA觀察到的結果一致；E1組1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏，E2組1只鼠可觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏，2組與C1組比較均例數減少。說明治療有效，E1和E2組比較在視網膜血管對碳素顆粒的滲漏上病變無減輕或加重，與FFA結果有出入，考慮是否與樣本例數少有關。上述結果更進一步印證了FFA得出的結論：不論在增殖前期治療還是在背景期治療均能減輕BDR的病變；背景期治療效果隨時間的延長而漸好，而增殖前期治療后2周時效果明顯，6周時效果減退。各組CD105免疫組織化學結果均呈陰性，表明背景期和增殖前期給予EPA玻璃體注射治療DR，均有效地阻止了PDR的發生。F組3只鼠均觀察到典型的微血管碳素顆粒滲漏，1只鼠視網膜切片CD105免疫組織化學染色為陽性，觀察到視網膜前膜，與FFA結果一致，從而進一步印證了FFA的結果。

綜上所述，EPA對臨床可見的DR血管增殖性病變存在著確切的治療作用，不同時期給予EPA治療的效果不同：在背景期給藥后2、4、8周時，隨時間的延長，對DR的治療效果越來越明顯，并能阻止增殖性血管病變的發生；在增殖前期給藥后2周時，對減輕DR背景期病變的治療效果優于 6周時，同樣能阻止增殖性血管病變的發生。增殖期給予EPA治療后不能阻止PDR血管性病變進展。（本文圖見封二）

［1］YANG SP，MORITA I，MUROTA SI.Eicosapentaenoic acid attenuates vascular endothelial growth factor-induced proliferation via inhibiting Flk-1 receptor expression in bovine carotid artery endothelial cells［J］.J Cell Physiol，1998，176（2）：342－349.

［2］董白霞，馬景學，葉存喜，等.二十碳五烯酸對體外培養的人血管內皮細胞增殖抑制效應的研究［J］.中華眼科雜志，2007，43（8）：726－733.

［3］HAMMES HP，WEISS A，FüHRER D，et al.Acceleration of experimental diabetic retinopathy in the rat by omega-3 fatty acids［J］.Diabetologia，1996，39（3）：251－255.

［4］董白霞，馬景學，葉存喜，等.增殖型糖尿病性視網膜病變動物模型的建立［J］.第三軍醫大學學報，2012，34（12）：1218－1222.

［5］BARBER AJ，ANTONETTI DA.Mapping the blood vessels with paracellular permeability in the retinas of diabetic rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（12）：5410－5416.

［6］RAKOCZY PE，BRANKOV M，FONCECA A，et al.Enhanced recombinant adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor expression in the adult mouse retina：a potential model for diabetic retinopathy［J］.Diabetes，2003，52（3）：857－863.

［7］MORITA I.Regulation of angiogenesis-expression of VEGF receptors［J］.Hum Cell，1998，11（4）：215－220.

［8］OZAKI H，SEO MS，OZAKI K，et al.Blockade of vascular endothelial cell growth factor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization［J］.Am J Pathol，2000，156（2）：697－707.

（本文編輯：許卓文）

本刊全面執行國家有關期刊編輯出版規范化標準化的說明

根據國家有關科技期刊編輯出版規范化標準化（國家標準）的規定，本刊自2011年第32卷第8期在原有認真貫徹執行國家標準規定的基礎上，進一步全面執行國家的最新標準和規定。因此，敬請廣大欲投本刊的作者在投稿前多加留意本刊在眾多細小地方的改變，盡力使自己的文稿符合國家標準和規范，以提高投稿的成功率。

《河北醫科大學學報》編輯部

IN VIVORESEARCH ON TREATMENT OF PROLIFERATIVE DIABETIC RETINOPATHY BY EICOSAPENTAENOIC ACID INTRAVITREOUSLY

DONG Baixia，YE Cunxi，BAO Yongqin，YAO Yimin，WEI Yuhua，YANG Xin
（Department of Ophthalmology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050000，China）

ObjectiveTo identify the utility of eicosapentaenoic acid（EPA）on diabetic retinopathy（DR）in vivo.MethodsProliferative diabetic retinopathy（PDR）Sprague-Dawley rat（n＝24）was induced by application of streptozotocin associated with vascular endothelial growth factor（VEGF）.Sprague-Dawley rats were randomly divided into D group（n＝12）representing medication administration group at background DR stage，E group（n＝ 8）representing medication administration group at pre-proliferation DR stage，F group（n＝4）representing medication administration group at proliferation DR stage，then EPA was injected intravitreously.Fundus pathological changes were observed by fluorescence fundus angiography（FFA），CD105 positive retinal vascular endothelial cells were observed by microscope with immunohistochemistry technique.The results were compared with diabetic rat models established in our prior study.ResultsFFA demonstrated the best effect in E group in two weeks after EPAinjection，whereas effective and augmented time-dependently in D group during eight weeks after EPA injection.In six weeks after EPA injection in E group，the effect decreased obviously as compared with that 2，4，8 weeks after EPA injection in D group.As compared with nonmedication group，retinal neovascularization was not detected at the same course of this disease.Retinal neovascularization was also detected and diabetic retinopathy was not relieved in EPA injected eyes in F group.CD105 immunohistochemistry described there were no CD105 positive vascular endothelial cells at the same course of disease in D and E group.But CD105 positive cells were still observed in F group.ConclusionEPA can suppress DR development by blocking VEGF receptor flk-1.

retinal diseases；vascular endothelial growth factors；fluorescein angiography

R774.1

A

1007-3205（2014）10-1148-04

2014－02－22；

2014－04－02

河北醫科大學第二醫院院基金資助項目（2h1200601）

董白霞（1975－），女，河北河間人，河北醫科大學第二醫院副主任醫師，醫學博士，從事眼外傷、眼底病診治研究。

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.010