人BMSCs復合載體支架修復軟骨缺損的研究進展

易穎，金旭紅，張壽

(海口市人民醫院骨科中心，海南海口570208)

·綜述·

人BMSCs復合載體支架修復軟骨缺損的研究進展

易穎，金旭紅，張壽

(海口市人民醫院骨科中心，海南海口570208)

我們廣泛查閱近年來有關人骨髓間充質干細胞及載體支架材料研究與應用的文獻，并選擇常見的幾種細胞載體支架材料分別進行闡述。人骨髓間充質干細胞作為最實現性的細胞源，將在軟骨組織工程的研究及應用中發揮重要的作用。理想的支架材料在種子細胞修復軟骨缺損中起到事半功倍的作用。人骨髓間充質干細胞復合現有支架材料仍存在許多問題。將人骨髓間充質干細胞復合自體脫鈣骨基質，成軟骨誘導促進軟骨缺損的修復，因其良好的穩定性與免疫學性能，值得今后更深入地研究。

人骨髓間充質干細胞；支架材料；永生化；脫鈣骨基質；軟骨缺損

由于外傷、創傷后慢性損傷、退行性變、關節退化等原因造成的關節軟骨受損在臨床上日趨常見。根據國際軟骨修復協會建立的軟骨損傷評價體系，將軟骨損傷按嚴重程度分為五級。其中特別是缺損完全穿透軟骨，到達軟骨下骨更是臨床難題。而關節軟骨本身的再生修復能力十分微弱[1]，一旦受損，組織破壞往往從關節表面持續延展的關節深層。這樣繼續發展將導致關節性病變或骨關節炎，更嚴重的晚期只能進行關節置換治療[2]。以往常用的骨髓刺激技術、自體或異體骨軟骨移植、骨膜軟骨膜移植等治療方法因存在著纖維化、退化或者二期骨化的問題，都難以取得理想的效果[3]。組織工程再生醫學技術的發展為其提供了一條新的思維方向。因此，如何修復軟骨缺損成為目前組織工程研究的熱點之一。

組織工程研究由種子細胞、支架材料、組織構建和細胞生長調節因子四大基本要素構成[4]。目前軟骨細胞組織工程研究的熱點及難點主要包括：尋找理想的種子細胞及其培養擴增方法、提供適當的細胞載體支架及固定方法和明確各種細胞因子的調控機理并誘導種子細胞分化等。

1 種子細胞的選擇

軟骨再生的潛在細胞源包括：同源軟骨細胞、間充質干細胞、胚胎干細胞和誘導多能干細胞等。間充質干細胞是最常用的軟骨組織工程種子細胞，具有良好的多向分化潛能和增值能力。它可以從骨髓、臍血等全身多處組織中分離提取，在一定的誘導條件下能夠分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等[5]。其中，骨髓是間充質干細胞的重要來源，具有取材簡便、來源充足、免疫原性弱、分化能力強等特點[6-9]，是最實現性的細胞源。

以骨髓間質干細胞為基礎的全層軟骨缺損修復已經在動物模型中有廣泛嘗試，但在臨床上應用于臨床軟骨修復的病例少見。在軟骨再生治療上還處于初期發展階段是由于來自以下的幾個挑戰。

1.1 年齡對種子細胞的影響在臨床上，隨著時間不斷磨損導致的退行性關節病變以及長期缺乏活動導致的關節退變的老年患者在關節軟骨缺損的病例中占有不小的比例。這說明年齡與其具有非常重要的關系，年長的患者體細胞質量低下。隨著年齡的增長，患者體內骨髓間充質干細胞的含量、質量和活性等是否也隨之下降？國內外研究者目前看法并不一致。早在二十世紀末，Nishida等[10]研究提示隨著年齡增長骨髓間充質干細胞自我更新能力逐漸下降。Pittenger等[11]研究人骨髓間充質干細胞的增殖能力與成骨方向分化的潛能，發現骨髓間充質干細胞的增殖能力與年齡及性別之間沒有明顯的關系。近年又有學者研究顯示骨髓間充質干細胞的含量質量活性等隨著年齡的增長而下降[12]。若采用同種異體骨髓間充質干細胞修復老年患者的關節軟骨缺損又存在免疫排斥反應。

1.2 種子細胞的免疫學特點在自體種子細胞取材有限或適應證受限的情況下，可以考慮采用同種異體細胞。骨髓間充質干細胞具有低免疫原性，并且可以直接抑制活化的效應性CD4+T細胞增殖和激活并維持Treg細胞的潛能[13]。在異體間質干細胞分化成為功能性的軟骨細胞，它們就會逐漸失去免疫抑制效應，其免疫原性得到增強。為了增加細胞數量而長時間的體外培養過程中，種子細胞的表型可能會發生自發的改變。這表明異體之間的間質干細胞因其免疫學的特點或許并不適用于軟骨組織的修復。雖然低溫冷凍可降低軟骨細胞免疫原性，但也會導致軟骨細胞活性丟失。目前研究多采用冷凍一周內的新鮮組織細胞移植，可盡量降低免疫排斥反應又能維持更長時間關節軟骨的功能[14]。Froncois等[15]發現骨髓間充質干細胞不僅可遞呈可溶性抗原，而且可介導CD8+T細胞免疫反應。骨髓間充質干細胞在體外可抑制細胞增殖，但體內試驗卻未能抑制移植物抗宿主反應。當間充質干細胞在體外誘導分化成成軟骨細胞的過程中，其生物學特性發生了改變，原高表達的負性協同刺激分子下調，而多種原不表達的正性協同刺激分子不同程度的進行上調抗原提呈細胞的抗原遞呈作用，將抗原信息傳遞給T細胞，引起T細胞活性。

1.3 種子細胞的永生化與致瘤性骨髓間充質干細胞在培養過程中存在著細胞老化、干細胞樣特征丟失的現象。有研究者提出“永生化”的概念。Tsai等[16]將端粒末端轉移酶反轉錄酶的片段phTERT-IRES2-EGFP轉染入KP細胞，建立了3A6細胞系，發現新建立的細胞系與原始骨髓間充質干細胞相比，其增生能力、干細胞樣特征均提高，多次傳代導致細胞自動分化，干細胞樣特征丟失的問題也得到一定解決。國外學者在體外利用基因轉染技術，將尤因肉瘤易位癌基因家族蛋白基因植入人的間充質干細胞后，細胞的形態從紡錘體的外形變為小圓形或多角形，而后者其實是腫瘤細胞的形態之一。且原本間充質干細胞應有的表型如CD10、CD13等消失。相反，尤因肉瘤細胞的表型如CD54、CD99、CD117、CD271表達強度有明顯的上調。這表明尤因家族腫瘤可能來自于人間充質干細胞[17]。還有更多的實驗提示間充質干細胞可能與惡性腫瘤的關系密切，其惡性轉化及移植后潛在的致瘤性引起普遍關注，人們越來越關心間充質干細胞移植治療的安全性；上述問題目前還知之甚少，都有待深入闡釋。

2 細胞載體支架的選擇

以生物材料作細胞生長的三維支架，利用組織工程技術生產用于移植治療的軟骨組織成為當前研究熱點。支架材料作為人工的細胞外基質，主要作用是模擬細胞在體內的生長空間，為細胞形成軟骨提供一個繼續增殖分化的微環境。它為軟骨細胞提供三維空間結構，有利于細胞的粘附、增殖，為細胞的生長提供良好的生長環境。理想的支架材料要具備良好的生物相容性、生物降解性、良好的三維空隙結構、較好的承載能力與彈性以及不易脫落等特點[18]。目前尚無一種具有明確優勢的組織工程支架具備以上所有特點，到目前為止，任何組織工程替代物都難以完全的模擬天然軟骨的結構和性質[19]。

目前常用的支架材料按其來源分為人工合成支架材料、天然支架材料、復合支架材料和納米生物材料。

2.1 人工合成支架材料由于在人工合成過程中能直觀地設計和調控其微結構、機械強度等材料性能，并且易于生產，人工合成高分子支架材料是目前應用程度最廣、研究最多的支架材料。目前常用的人工合成的高分子支架材料主要包括以下[20]：聚乳酸、聚乙醇酸、β-磷酸三鈣、聚羥基乙酸、聚氧化乙烯等。研究者們通常將這些生物材料制成網狀或海綿狀，多孔的設計具有的特點是其材料的內部三維空間與細胞生存的環境相類似，使得細胞能高效率地進行新陳代謝。早在上世紀九十年代，Vacanti等[21]首先以聚羥基乙酸、聚乳酸作為軟骨細胞體外培養基質材料，通過組織工程方法成功獲得新生軟骨。但其降解過快，降解產物在局部聚集影響局部酸堿平衡，從而產生炎癥反應，影響種子細胞的生長增殖。同樣其他人工合成支架材料也存在如親水性弱、表面活性不足、粘附性弱、具有一定免疫原性等缺點。

2.2 天然生物支架材料目前應用于軟骨組織工程的天然支架材料主要有：天然基質材料、膠原材料、殼聚糖、纖維蛋白、透明質酸等。天然生物支架材料來源于生物體本身，具有組織相容性較好、毒性較小、易降解且降解產物易被人體吸收而不產生炎癥反應等優點，所以在組織工程中作為細胞培養的支架材料具有人工合成材料所不可比擬的優勢。

2.2.1 天然基質材料采用脫鈣松質骨基質作為支架材料相對生物合成高分子材料，從1965年首次提出了脫鈣骨基質具有成骨誘導能力，到1979年提出骨形態發生蛋白學說，目前脫鈣松質骨已廣泛運用于組織工程研究。脫鈣松質骨的主要成分是膠原，它保留了天然的骨蛋白和生長因子[22]，與細胞聯合應用中具有骨誘導、骨傳導及骨發生能力[23]。孔徑大小一般控制在100～500 μm。材料具有生物降解性，其降解產物能被正常吸收，不對周圍環境造成影響。pH值的變化小，不產生炎癥反應。在骨缺損研究中，骨形態發生蛋白能誘導間充質干細胞分化為成骨細胞，進而生成新的骨組織[24]，并且能影響到鄰近骨細胞，促進其分泌膠原支架。尤其取自體骨更能最大程度上降低抗原性，抑制免疫排斥反應，因此可以作為修復骨缺損及骨組織工程的支架材料，為骨缺損的治療開辟了一條新途徑。2007年，骨蛋白提取物作為新一代的脫鈣骨基質修復材料開始成為熱點。骨蛋白提取物是從長骨皮質骨中提取的淺黃白色、絮狀的膠原基質凍干產物，含有Ⅰ型膠原及其他難溶性蛋白，如轉化生長因子等。Baas等[25]和Ding等[26]分別進行狗和羊等動物實驗中均無與骨蛋白提取物有關的并發癥發生，表現出良好的生物相容性。在臨床應用中，骨蛋白提取物已開始應用于關節翻修、脊柱融合、骨缺損等手術中。

2.2.2 膠原材料膠原作為細胞外基質的主要成分，含有利于細胞粘附的基團。膠原是主要的支持組織的結構蛋白，其中Ⅰ型膠原以粗纖維形式存在，可以形成較大的網絡結構使組織具有較強的抗張能力，而Ⅲ型膠原的結構是以細纖維為主，組織通過細纖維而具有較強的可擴張能力。Ⅲ型膠原分布于全身各處，多見于皮膚、血管、肺、心臟等，一般是跟隨Ⅰ型膠原的出現而出現的。軟骨外基質占軟骨比重的一半左右，軟骨外基質的主要成分是由軟骨細胞所分泌的Ⅱ型膠原。在軟骨組織工程中，Ⅱ型膠原往往提示軟骨細胞生長是否良好。在進行軟骨細胞培養時，Ⅱ型膠原能為細胞的生長和增殖提供良好的微環境。膠原蛋白作為支架材料有利于細胞的粘附、增殖和分化，并能刺激軟骨細胞分泌軟骨基質Ⅱ型膠原和糖胺聚糖。膠原的降解產物氨基酸可以被機體完全吸收，其最大缺點是力學強度不夠，被大大限制了應用，所以通常都是將膠原與其他材料復合或作為支架的表面修飾物以增加支架的細胞粘附性。

2.2.3 殼聚糖殼聚糖是常用的天然高分子材料，在生物的相容性和降解性上性能優異。再者，研究者根據實驗需要選擇相關的生物活性，只需要改造其側鏈的修飾基團。一般地，多糖類大多可以作為軟骨細胞載體。有學者將軟骨細胞植入由殼聚糖制成立體支架，培養一段時間后顯示有糖胺多糖及Ⅱ型膠原生成，這說明殼聚糖能維持軟骨細胞的表型穩定性。殼聚糖使植入的種子細胞與宿主組織一體化。國外學者發現殼聚糖能使軟骨種子細胞的形態學長時間內不易發生變化，并能使支架的粘附性和結構保持穩定。Hao等[27]用殼聚糖結合軟骨細胞修復羊的軟骨缺損，24周的培養后發現，羊的軟骨缺損得到完全修復。另外，單純的殼聚糖水凝膠，不結合細胞，也有助于對軟骨缺損進行修復。

2.3 復合支架材料隨著組織工程學技術的深入，單一的支架材料通常因為局限性，并不能滿足軟骨缺損修復的現實要求。復合多種支架材料可以發揮各自優點,可以促進組織工程產品的修復重建效果。復合材料是指將不同的材料按需要復合，或者利用物理、化學、生物等方式或仿生學原理改變或模擬現有材料的特性，使新生材料擁有需要的優勢，規避劣勢。復合材料可以是天然材料之間的復合或人工合成材料之間的復合，以可以使兩者之間的交叉復合。目的只為得到具有我們需要的相關的支架材料。值得特別提出的是，目前剛起步的納米生物材料。納米技術在骨移植替代物有納米羥基磷灰石、納米骨漿、納米脫鈣骨基質、納米級類骨磷灰石晶體等。納米材料的結構優勢在于有大量的界面或自由表面。結構單元之間存在一定的相互作用，互相影響。用納米材料制成的支架其靶向性能和延展性能都具有優勢。將納米材料與其他材料復合能改變材料的力學性能。若復合生長因子，可能會大大地提高其作用。將其進行一定的技術處理或表面修飾，處理后的納米材料或許是最理想的支架材料。

3 人骨髓間充質干細胞成軟骨的定向誘導

骨髓間充質干細胞分化為軟骨細胞受到多種復雜因素的影響和調控，其中很多機制目前還不清楚。體外培養條件下需要控制細胞生活條件，選擇合適的細胞因子，盡量模擬人體內成軟骨環境，構建成熟的定向分化系統。骨髓間充質干細胞向軟骨細胞誘導方法包括體外高密度微團培養、體外單層細胞培養、體外三維支架環境誘導、與軟骨細胞體外共培養誘導劑基因轉染誘導等。Noble等[28]于1995年首次成功地誘導了間充質干細胞向單一的軟骨細胞分化。隨后的大量研究也證實了骨髓間充質干細胞的體內體外成軟骨能力[29]。間充質干細胞具有多向分化潛能，在人工培養條件下如果不添加細胞因子，會發生自然分化[30]，出現增殖能力下降，失去原有典型長梭形形態，向多分支和多角形發展。轉化生長因子-β1對多種細胞的生長和分化都起作用。很早就有實驗證實轉化生長因子-β1可以誘導間充質細胞轉化為軟骨細胞,轉化生長因子-β1具有促進軟骨細胞增殖、調節其分化和胞外基質合成的能力,轉化生長因子-β1和其他多種生長因子有協同作用。骨髓間充質干細胞在向軟骨細胞分化的過程中，隨著基因的激活，會合成軟骨細胞特有蛋白質產物。其中的Ⅱ型膠原和糖胺多糖是細胞外基質中的主要成分，可以作為鑒定軟骨細胞的標志物。生長分化因子5是近年發現的一種生長因子，屬骨形態發生蛋白家族成員，也是轉化生長因子超家族一員，也稱為軟骨源性形態發生蛋白1。它能影響到生長板軟骨細胞肥大時期的長短，從而影響到內生軟骨的生長速度。它通過上調縫隙連接蛋白Cx43的表達來促進人骨髓間充質干細胞微團向軟骨定向分化。這在早期骨骼發育和關節形成與發育中發揮關鍵的作用。

4 展望

近年來，干細胞和組織工程技術的不斷發展，為解決臨床難題帶來曙光。軟骨組織工程已成為國內外學者的研究熱點。將人骨髓間充質干細胞復合自體脫鈣松質骨基質，成軟骨誘導促進軟骨缺損的修復，因其良好的免疫學性能，值得今后更深入地研究。然而，軟骨組織工程技術并不完美，在進入臨床應用以前還有很多問題等待解決，例如支架容易脫落，細胞在體內免疫性狀的改變以及致瘤性的問題。都還需要進一步理解參與軟骨再生的各種因素及其影響因子，同時還要在標準化動物模型研究中衡量積極因素和可能的有害影響。不過，相信隨著對軟骨組織工程研究的深入，大量實驗研究及臨床工作，必將進一步推動軟骨組織工程由動物試驗階段向臨床試驗階段過渡，并最終成功應用于臨床。

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1003—6350（2014）01—0058—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.01.0021

2013-06-26)

海南省自然科學基金項目（編號：309107）

金旭紅。E-mail：jxh53@sina.com