遲鈍愛德華氏菌在水產動物中致病性及致病因子的若干研究

劉雙鳳

（哈爾濱市農業科學院水產研究分院 黑龍江 哈爾濱150028）

遲鈍愛德華氏菌又稱遲緩愛德華氏菌或緩慢愛德華氏菌，屬于腸桿菌科的愛德華菌屬（E d w a r d s i e l l a）。它是該細菌家族中較早發現的成員之一。于1959年由日本的S a k a z a k i和M u r a t a首先從蛇的腸道中分離得到。E.t a r d a是一種革蘭氏陰性短桿菌，沒有莢膜、芽孢，長度約2~3 μm，直徑約l μm，有周生鞭毛，能運動。該菌為兼性厭氧菌，生長溫度范圍為5~42℃，最適生長溫為25~35℃；適宜p H范圍為5.5~9.0，但p H7.2時生長較好；耐鹽濃度范圍為0~4%。同時，E.t a r d a可產H2 S，能在膽硫乳瓊脂(D H L)上形成黑色中心的特征菌落。

H o s h i n a于1926年首次從養殖的鰻鱺中分離獲得魚源E.t a r d a分離株，并發現該菌與日本鰻鱺紅病（R e d d i s e a s e）有關。近年來，水產養殖的規模化使E.t a r d a成為嚴重威脅淡、海水魚類的細菌性病原，給水產養殖業造成巨大經濟損失。該菌能引起多種經濟魚種的消化道疾病，其感染引發的出血性敗血癥被認為是遲鈍愛德華氏菌病的典型病癥。此外，E.t a r d a病害的地理范圍很廣泛。我國渤海、黃海、東海沿海海域的養殖場，甚至內陸的淡水魚、鱉等養殖場都有相關病例報道。另外，E.t a r d a還具有兼性胞內寄生特性，是一種造成人、魚共患病的機會致病菌，直接威脅人類健康。早在1996年J o r d a n等就報道了人感染E.t a r d a的病例。目前為止，由生食魚類制品或機體創傷造成的人類感染E.t a r d a病例呈現逐年增長的趨勢，且能誘發多種并發癥。因此，在全面認識E.t a r d a毒力因子和致病機制的基礎上，開發具有自主知識產權的減毒活疫苗，已成為我國乃至整個世界實現可持續發展戰略的重要健康保障。

1.1 血清學方面的研究

P a r k e t a l對從養鰻池中分離到的幾百株遲鈍愛德華氏菌進行血清學實驗，發現可以分成4個血清型: A、B、C和D，其中血清型A主要從腎臟中分離所得而且致病力最強。N a k a t s u g a w a首次報道了從牙鲆中分離到了一種無運動性的非典型遲鈍愛德華氏菌，可引起牙鲆發病。C o s t a e t a l從鯛中也分離到了這種菌，血清學研究表明這種菌與典型的從其它魚類分出的菌株有相似的表面抗原，因此認為可以發展一種共同的疫苗針對這兩類病原。

1.2 與致病因子有關的研究

遲鈍愛德華氏菌致病機理的研究，尚處于起步階段。尋找研究致病物質是了解病原致病機理的重要環節。

1.2.1 胞外產物

實驗證明，水產動物病原菌的胞外產物中具有多種酶活性，其中蛋白酶(明膠酶或酪蛋白酶等)的活性對病原菌的致病性具有重要作用，目前已經發現，殺鮭氣單胞菌（A.s a l m o n i c i d a）、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌（P.a e r u g i n o s a）、熒光假單胞菌（P.f l u o r e s c e n s）、鰻弧菌（V.a n g u i l l a r u m）、溶藻膠弧菌（V.a l g i n o l y t i c u s）、副溶血弧菌（V.p a r a h a e m o l y t i c u s）、創傷弧菌（V.v u l n i f i c u s）、黃桿菌（F l a v o b a c t e r i u ms p.）等多種魚、蝦類病原菌均可產生具有強烈致病作用的胞外蛋白酶。在多數病原菌的胞外產物中發現的蛋白酶都具有熱不穩定性，但T h u n e等（1982）發現嗜水氣單胞菌可以產生2種胞外蛋白酶，1種為熱穩定性蛋白酶，對鯰魚具有較強的致病力；另1種為熱不穩定性蛋白酶，其致病力較弱。T a n a k a等認為，副溶血弧菌產生的胞外蛋白酶是一種誘導酶，在有明膠或其水解產物存在的條件下，蛋白酶的產生量為非誘導條件下的40倍左右在細菌的生長早期，蛋白酶的分泌幾乎完全缺乏，到了生長后期便開始迅速增加。

H o s h i n a報道稱熱滅活的遲鈍愛德華氏菌細胞對日本鰻鱺有致死作用，但培養液上清無致死作用。而S u p r a t o e t a l研究發現，該菌細胞內容物和胞外產物都有致死作用，而胞外產物是直到細菌培養后期才有致死作用，認為是由于后期發生溶細胞作用使內容物釋放導致。S u p r a p t o e t a l從該菌的E C P（胞外產物）和I C C（胞內成分）中分離到一種具有蛋白水解酶活性的物質，對鰻有致死作用。陸承平證實遲鈍愛德華氏菌的胞外產物的的細胞毒性與動物致病性平行，說明胞外產物是一種毒力因子。

1.2.2 內毒素和外毒素

H o s h i n a認為，遲鈍愛德華氏菌起致病作用的主要為內毒素。U l l a h等報道，遲鈍愛德華氏菌能產生外毒素，該毒素能使兔發生皮膚壞死。J a n d a等發現，遲鈍愛德華氏菌培養上清對H E p-2細胞有毒性。S u p r a p t o等報道，遲鈍愛德華氏菌同時存在內毒素和外毒素。另外發現了兩種外毒素，一種可引起兔皮膚紅斑，另一種可引起兔浮腫和潰瘍性紅斑。C h u n g e t a l從該菌中發現了幾種具有磷脂酶活性的外毒素，分別對磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和鞘磷脂等有特異活性。M a t h e w l e t a l利用基因突變的方式進行研究，發現遲鈍愛德華氏菌的芳基硫酸酯磺基轉移酶（a r y l s u l f a t e s u l f o t r a n s f e r a s e）基因和過氧化氫酶前體蛋白（c a t a l a s e p r e c u r s o r）基因發生突變時都可引起遲鈍愛德華氏菌毒性的大大降低。

1.2.3 溶血素

溶血素是多數病原菌的重要致病因子之一，目前已在殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、副溶血弧菌以及銅綠假單胞菌等病原菌的胞外產物中檢測到。Y a n a g a s e等認為，副溶血弧菌產生的多種酶類均可引起溶血作用，包括磷脂酶A，溶血磷脂酶及其它2種直接溶血因子，一種為熱穩定性因子，另一種為熱不穩定性因子根據N o m u r a和S a i t o的結論，溶血素最初可能是以一種沒有溶血活性的前體形式存在，至細菌生長的對數后期，在細胞內形成并結合在細胞內膜上;至細菌生長穩定期，隨著細胞的自溶裂解而釋放到培養基中。

J a n d a等（1993）報道，E T溶血素呈細胞結合狀態，在常規條件下只有少量分泌到胞外，當外界環境缺鐵時，胞外溶血素的分泌量是常規條件下的3～40倍。C h e n&H u a n g發現遲鈍愛德華氏菌可以分泌一種溶血素可以使羅非魚紅細胞壁產生孔洞。陸承平等報道，E T能產生兩種類型溶血素，即細胞結合性溶血素和胞外溶血素。培養基中加入螯合劑E D D A，造成外界環境缺鐵，E T21、S A8318、J F、122、735這5株出現兩種情況，兩株（E T21、S A8318）的胞外溶血素分泌顯著增加，而其余三株（J F、122、73）胞外溶血素的分泌無明顯變化。可見，E t產生溶血素的機制有一定的復雜性，細胞結合性溶血素的分泌未必受鐵調控，這J a n d a等的說法有異，有待進一步證實。

1.2.4 侵襲素（粘附素）

U l l a h&A r a i在研究的菌株中沒有發現專門的侵襲素或粘附素，只是發現了一種粘性物質可能與粘附和抵抗宿主的進攻有關系。歐陽志明等報道，15株E T均能凝集紅細胞，但只有10株能粘附H e p-2細胞，其粘附能被純化的鞭毛所抑制。綜上分析，E T的粘附素組成較復雜，至少包括血凝素蛋白和鞭毛蛋白，不屬于一種結構多種功能的模式。E T作為一種腸道致病菌，對宿主腸粘膜上皮是否也能像對H E p-2細胞一樣具粘附作用，其粘附素及其受體是否與體外模型顯示的結果一致，均有待進一步證實。

L i n g e t a l利用綠色熒光蛋白(G F P)研究體外遲鈍愛德華氏菌對鯉魚上皮瘤細胞的粘附與入侵，發現該菌的內化需微絲和蛋白酪氨酸激酶的作用，蛋白激酶C抑制劑可加速非毒性菌株的內化，M A P K抑制劑則可阻礙毒性菌株的入侵。這為研究該菌與宿主關系提供了一種有用的工具，即綠色熒光蛋白。L i n g e t a l又利用G F P標記的該菌研究發現，腸道、鰓和體表是該菌入侵的位點。

1.3 其它

M i n a g a w a e t a l稱一年四季都可從日本鰻鱺養殖池的水樣和泥樣中分離得到遲鈍愛德華氏菌，并且隨水溫的升高，分離到的菌的數量也越多。I s h i h a r a&K u s u d a研究發現水溫高時，從注射過遲鈍愛德華氏菌的日本鰻鱺體內釋放病原的速度要比在低溫時快，若死去的魚體留在水中則水中的病原數量會迅速提升，比取走死魚的水中菌量高3個數量級。

綜上所述，盡管國內外對遲鈍愛德華氏菌進行了大量的研究，但其治病機理仍沒有徹底搞清。在防治方面，由于使用抗生素類藥物的弊端，積極發展非抗生素類藥物勢在必行;而傳統免疫的方法從目前的研究狀況看，效果不是很理想;營養免疫，從提高宿主本身的抗病機能出發，是一個比較好的發展方向;生物防治，從生態學角度出發，從根本上改善養殖環境，防止病害的發生，是很有發展前景的途徑，但這一研究方向正處于初級階段，而且有較高的條件要求，所以還有大量的工作要做。鑒于該菌能夠導致多種嚴重的人類疾病，對該菌進行深入的研究，防止和減少水產養殖中該病的發生，對于保護生產和保護人類健康都具有極其重要的義。