柑桔大實蠅老熟幼蟲和蛹過冷卻點和結冰點的測定

黃 聰，李再園，王福蓮*，張桂芬，李傳仁，李詠軍

(1.長江大學農學院，湖北 荊州 434025;2.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193)

昆蟲屬于變溫動物，溫度是影響其種群動態的一種最基本的因素，在某些地區，寒冷冬季的持續低溫對昆蟲種群的延續構成了嚴重威脅，因此昆蟲往往通過調節自身的過冷卻 (supercooling)狀態以增強其抗寒性，使其種群得以繁衍和延續(Maureen and Richard，1990;崔雙雙和賀一原，2011)。昆蟲過冷卻是指溫度低于昆蟲體液結冰點時，其體液仍能保持液體狀態的現象 (李冰祥等，1998);耐寒性是指昆蟲維持蟲體的過冷卻狀態，使之免受凍害的能力 (Lee，1989)。在昆蟲耐寒性研究中，過冷卻點 (supercooling point，SCP)常作為一項重要指標來界定昆蟲的耐寒性強弱 (侯柏華和張潤杰，2007)。通過過冷卻點的測定，有助于了解某種昆蟲的抗寒能力，更好地掌握其生殖、擴散、發生分布規律以及下一季節的種群發生狀態等 (McDonald et al.，1999;Sage et al.，1999)。McDonald等 (2000)的研究指出，明確昆蟲的耐寒性及其越冬生物學特性，對于掌握其在某一地區的分布現狀、種群擴張趨勢，以及實時預測預報和根治等均具有重要作用。

柑桔大實蠅為一化性昆蟲，成蟲產卵于柑桔幼果內，卵孵化為幼蟲后，取食桔瓣，于柑桔內完成發育;10月中下旬幼蟲脫果入土化蛹，11月上中旬大部分幼蟲已入土化蛹，進入越冬狀態;翌年3月下旬至4月上旬滯育蛹解除滯育開始發育，4月下旬至5月上旬成蟲開始羽化 (吳志清，1958;羅祿怡和陳長風，1987;汪興鑒和羅祿怡，1995;王小蕾和張潤杰，2009)。因此，幼蟲和蛹對低溫的耐受能力以及當地冬季的溫度狀況共同決定了柑桔大實蠅的越冬蟲源基數，進而影響來年柑桔大實蠅的發生動態和種群發生數量。本研究擬通過測定柑桔大實蠅老熟幼蟲和滯育蛹以及已解除滯育進入發育狀態的蛹的過冷卻點和結冰點，以期揭示柑桔大實蠅的耐寒性及其對低溫的適應能力，為準確預測其在我國的適生區、擴散區域及蟲源地越冬蟲口基數，為有效預測和制定柑桔大實蠅綜合防控策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

柑桔大實蠅的老熟幼蟲于10月下旬采自湖北省松滋市斯家場鎮旗林村。老熟幼蟲化蛹后已進入滯育狀態的5日齡蛹作為滯育蛹 (范京安等，1994);翌年4月上旬當越冬蛹發育為一級時，作為已解除滯育進入發育狀態的蛹。

1.2 過冷卻點的測定

過冷卻點的測定參考秦玉川和楊建才 (2000)以及呂龍石等 (2010)的方法，測定儀器為數字萬用電表 (DT 9205A，廣州恒惟電子科技有限公司)以及熱敏電阻 (NTC－MFH103，10KΩ，精度1%，25℃ B值3950;杭州電子市場恒堅電子商行)。測定前用潔凈濾紙吸干老熟幼蟲或蛹體表面的水分，用自制的昆蟲夾 (由晾衣竹片夾和溫敏電阻組成，竹片夾由兩瓣竹片和一根彈簧組成，每瓣竹片長6.2 cm，寬1.1 cm，厚0.6 cm，竹片內側中間位置均勻分布有3個直徑為0.4 cm的凹槽，兩端凹槽距竹片端部均為2 cm，兩片竹片并攏時上下凹槽組成3個直徑為0.4 cm、高1.1 cm的圓柱型空間，其中彈簧固定在竹片夾一端的凹槽內，溫敏電阻固定于另一端的凹槽處)迅速夾住供試昆蟲 (使蟲體腹面緊貼熱敏電阻)，用脫脂棉包好昆蟲夾放入緩溫管 (50 mL指形管，長11 cm，直徑3 cm)內，于25℃可控低溫保存箱內(DW－25W198，青島海爾特種電器有限公司)進行電阻值變化的觀測。NTC－MFH103型玻璃熱敏電阻為負溫度系數熱敏電阻，亦即，隨蟲體體溫的下降，熱敏電阻值上升。當電阻值逐漸上升到某一數值R1i時，體液開始形成冰晶而放熱使電阻值突然下降，此時R1i所對應的溫度值即為過冷卻點;當下降到最低點R2i時，體液開始結冰，不再放熱，電阻值又會逐漸上升，此時R2i所對應的溫度值即為結冰點，觀察結束 (秦玉川和楊建才，2000;呂龍石等，2010)。每個蟲態過冷卻點和結冰點測定30－35頭。

1.3 數據分析

NTC－MFH103型玻璃熱敏電阻的溫度系數B值的計算公式為:B=t1t2ln(rt1/rt2)/(t2－t1)，其中 t1、t2為生產廠家提供的熱敏電阻 Ri(kΩ)在rt1和rt2范圍時所對應的溫度值，為絕對溫標ti+273.15;過冷卻點和結冰點溫度Ti(℃)的計算公式為:Ti=t2B/［B+t2ln(Ri/r2)］ －273.15，Ri為過冷卻點或結冰點所對應的電阻值(呂龍石等，2010)。

采用單一樣本Kolmogorov－Smirnov法檢驗分析不同發育狀態過冷卻點和結冰點的頻次分布特征，并以過冷卻點或結冰點值為橫坐標作相對頻率分布圖，以單一變量最小顯著差法進行方差分析 (SPSS)，比較柑桔大實蠅不同發育狀態的過冷卻點、體液結冰點及體液結冰點與過冷卻點之間差值的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 柑桔大實蠅不同發育狀態的過冷卻點、結冰點及其差值

柑桔大實蠅的發育狀態不同，其過冷卻點各異，而且三種發育狀態間的過冷卻點差異顯著(表1)。按過冷卻點由高到低依次為老熟幼蟲、滯育蛹和滯育解除蛹，分別為 －7.09℃、－8.93℃和－11.15℃;進而其耐寒性的高低依次為滯育解除蛹＞滯育蛹＞老熟幼蟲。已解除滯育進入發育狀態的蛹的過冷卻點變異范圍最大，為－15.36～－7.45℃;滯育蛹過冷卻點的變異范圍最小，為－11.09～－8.03℃。不同蟲態體液結冰點之間也存在顯著差異 (表1)，滯育解除蛹的結冰點最低為－9.76℃，其次為滯育蛹為 －7.63℃，而老熟幼蟲的結冰點最高為－3.43℃。其中，已解除滯育進入發育狀態的蛹的過冷卻點的變異范圍最大，最低值為－13.49℃，最高值為－6.64℃;滯育蛹過冷卻點的變異范圍最窄，最低值為－9.03℃，最高值為－6.64℃。老熟幼蟲結冰點與過冷卻點之間的差值最大為3.24℃，顯著高于滯育蛹(1.30℃)和滯育解除蛹 (1.39℃)。而且，老熟幼蟲結冰點與過冷卻點之間差值的變異范圍最大，最低值為1.39℃，最高值為6.15℃;滯育解除蛹的變異范圍最窄，最低值為0.61℃，最高值為2.45℃ (表1)。

表1 柑桔大實蠅不同發育狀態的過冷卻點、結冰點及其差值 (℃ ，Mean±SE)Table 1 The supercooling points(SCP)，freezing points(FP)and their differences among different developing status of Bactrocera minax

2.2 柑桔大實蠅不同發育狀態過冷卻點和結冰點的相對頻率分布

圖1 柑桔大實蠅不同發育狀態過冷卻點和結冰點的分布頻率Fig.1 Distribution frequency of supercooling point and freezing point at different developing status of Bactrocera minax

測定結果表明，三種發育狀態的柑桔大實蠅其過冷卻點和結冰點均只有一個高峰，而且經檢驗其頻次分布特征均符合正態分布。其中，老熟幼蟲的過冷卻點和結冰點較高，分別集中在－3.5～－9.5℃以及－1.5～－5.5℃;滯育蛹次之，分別集中在－7.5～－11.5和－5.5～－9.5℃;而滯育解除蛹的過冷卻點和結冰點最低，分別集中在－8.5～ －14.5℃和－6.5～ －12.5℃ (圖1A，B)。進而表明，經過冬季低溫馴化已進入發育狀態的蛹的抗寒性最強，其次為剛剛進入滯育狀態的蛹，而老熟幼蟲的抗寒性最弱。

3 結論與討論

昆蟲的越冬策略主要有兩種類型，一是不耐結冰型 (freezing intolerant)，又稱避凍策略，這類昆蟲對體液中的冰晶所形成的損傷特別敏感，但它能盡量降低自身的過冷卻點，從而避免體液結冰以增強耐寒力，絕大多數昆蟲屬于這一類型;二是耐受結冰型 (freezing－tolerant)，又稱耐凍策略，這類昆蟲能夠主動地形成冰核，通過提高過冷卻點以誘導細胞外液在較高的亞致死溫度下結冰，阻止細胞內液的進一步結冰，使胞內亞細胞結構免受傷害，從而避免造成更大的損傷 (Bale，2002;Jason and Richard，2002;Renault et al.，2002;景曉紅和康樂，2002;Brent et al.，2003)。本實驗結果表明柑桔大實蠅的越冬策略屬于避凍策略，老熟幼蟲過冷卻點為－7.09℃，化蛹后通過降低自身過冷卻點至－8.93℃進入滯育狀態，從而增強耐寒性;翌年4月份，在外界環境因素的作用下，柑桔大實蠅滯育蛹解除滯育后，其過冷卻點再次降低至－11.15℃，說明越冬后進入發育狀態的蛹抗寒能力較滯育蛹更強。黃大樹等(2007)研究發現，柑桔大實蠅越冬后蛹的抗逆性比越冬前蛹的抗逆性更強，越冬前11月上旬挖蛹預埋，越冬后的死亡率高達84.5%;而越冬后4月上旬挖蛹，以同樣的方法預埋，其死亡率僅為34.5%。進而表明，經過自然低溫的冷馴化，柑桔大實蠅的抗寒能力增強了，亦即，抵御早春突發低溫危害的能力更強了 (Lee et al.，1987;Maureen and Richard，1990)。

近年來，在大量的昆蟲抗寒性研究中，過冷卻點已經成為評價昆蟲耐寒性強弱的一個重要指標，但某些昆蟲的大量死亡常出現在過冷卻點以上的亞致死溫度 (Maureen and Richard，1990)，因此過冷卻點并非評價昆蟲耐寒性的唯一指標，亦不能作為昆蟲存活的下限溫度;除過冷卻點以外，界定昆蟲耐寒性的指標還有昆蟲的體液結冰點和低溫存活能力等 (Bale，1996;Nedved et al.，1998;Chen and Kang，2002;Renault et al.，2002)。本研究結果表明，柑桔大實蠅滯育蛹和滯育解除蛹的過冷卻點均較老熟幼蟲的低，而范京安等(1994)的研究指出，柑桔大實蠅蛹的抗寒能力較老熟幼蟲弱，老熟幼蟲在0℃條件下可成活20 d以上，少數可達29 d;在3℃時，93%以上的老熟幼蟲能完成化蛹，死亡率極低;而蛹在3℃處理30 d后全部死亡，6℃處理30 d，只有26.6%的蛹能羽化為成蟲，這可能與蛹解除滯育后暴露在低溫環境中有關 (范京安等，1994)。Renault等 (2002)的研究顯示，即使在其過冷卻點以上的低溫環境中，暴露較長的時間也會導致昆蟲的死亡，這可能與幼蟲和蛹經過低溫馴化后獲得的抗寒能力的大小不同有關。本文結果中老熟幼蟲的結冰點和過冷卻點之間的差值最大，這種差值的大小是否與其在低溫馴化過程中獲得的抗寒能力的大小有關?尚有待進一步研究。

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