KIR3DL1分子遺傳多態性及其與疾病關聯的研究進展

陳達香，鄧志輝綜述，喻瓊審校

(1、大連醫科大學，遼寧大連116044；2、深圳血液中心，廣東深圳518035)

·綜述·

KIR3DL1分子遺傳多態性及其與疾病關聯的研究進展

陳達香1，鄧志輝2綜述，喻瓊2審校

(1、大連醫科大學，遼寧大連116044；2、深圳血液中心，廣東深圳518035)

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)是表達于人類NK細胞和部分T細胞表面的一類重要受體，KIR分子配體主要為HLA-I類分子，二者共同調節NK細胞的活性。KIR基因家族包含了14個功能性框架基因和2個假基因。功能性KIR3DL1框架基因編碼抑制型受體，該受體與靶細胞表面的HLA-Bw4-80I結合，傳導抑制信號；其分子遺傳多態性主要體現在等位基因、單倍型組成、群體差異等不同水平層次。當前KIR3DL1常規檢測方法包括序列特異性引物-PCR(PCR-SSP)、流式磁珠序列特異性寡核苷酸探針(Flow-rSSO)分析及測序分型技術(PCR-SBT)。迄今已發現KIR3DL1框架基因與乙型肝炎、HIV-1感染等病毒感染性疾病相關聯。

KIR3DL1；框架基因；多態性；病毒感染性疾病

天然殺傷細胞(natural killer cell，NK)是機體固有免疫系統的重要組成部分，近年來NK細胞的免疫調節作用受到人們的廣泛關注。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs)是表達于人類NK細胞表面和部分T細胞表面的一類重要受體，通過與靶細胞表面相應的HLA-I類分子結合，傳導激活或抑制信號，調節NK細胞活性。KIR3DL1是其中的一員，與特異配體結合后傳遞抑制信號，抑制NK細胞的殺傷作用。KIR3DL1基因具有高度多態性，本文就KIR3DL1基因結構、配體、等位基因命名方式、分子遺傳多態性、分型方法及其與疾病的關聯等方面的研究進展作一綜述。

1 KIR3DL1的分子結構

KIR3DL1分子為I型跨膜糖蛋白，包括胞內區、跨膜區及胞外區。KIR3DL1胞質區的胞漿結構域較長，有2個免疫受體酪氨酸抑制性基序(ITIM)，當ITIM發生磷酸化時，可募集磷酸酶SHP-1和SHP-2，導致細胞活化底物的去磷酸化，從而下調NK細胞的活性。胞外區含有3個免疫球蛋白樣結構域，分別為D0、D1和D2。D0在細胞膜的遠端，D2在細胞膜近端，D1介于D0與D2之間；D0、D1、D2分子分別由95、102、98個氨基酸殘基組成[1，2]。人類KIR3D L1的D1和D2結構域選擇性表達，形成9個與HLA分子作用的結合基序(motif)[3]。

2 KIR3DL1的基因結構

KIR3DL1框架基因位于人類19號染色體(19ql3.4)的LRC區(Human Leukocyte Receptor Complex，LRC)，從5’-啟動子到3’-UTR區全長序列約為14 kb，已知的KIR3DL1中除了KIR3DL1 *059、*060、*061和*065外，其余的KIR3DL1等位基因的cDNA長度為1335 bp。KIR3DL1基因含有9個外顯子、8個內含子；其中外顯子1和2編碼引導肽，外顯子3、4、5分別編碼胞外D0、D1、D2免疫球蛋白樣結構域，外顯子6和7分別編碼胞外結構域與膜之間的連接區和跨膜區段,外顯子8和9則編碼胞內段。

3 KIR3DL1分子的配體

KIR3DL1的配體為含有Bw4表型的HLA-B分子。Bw4表型取決于HLA-B分子α1螺旋體77～83位氨基酸殘基的組成。目前一致認為HLA～Bw4-80I(I為異亮氨酸)為KIR3DL1的配體；有學者認為HLA-Bw4-80T(T為蘇亮氨酸)也是KIR3DL1的配體，但存在爭議。二者之間的作用模式：KIR3DL1的D1和D2結構域的氨基酸殘基與HLA-I類分子相互作用，D0域加強二者間的結合[3]，受體、配體間相互作用，傳導抑制信號，下調NK細胞的活性。

4 KIR等位基因的命名

KIR基因的命名方式，以KIR前綴開始，緊接著是KIR框架基因的名稱，其后接“*”號，“*”之后的前3位數表示等位基因，即編碼區的非同義突變；第4、5位數表示編碼區的同義突變；第6、7位數表示非編碼區的堿基取代。

5 KIR3DL1分子遺傳多態性及其表達水平的差異

5.1 KIR3DL1的遺傳多態性KIR3DL1的遺傳多態性主要體現在等位基因、群體遺傳、單倍體組成等不同水平層次，本文主要對前兩方面進行闡述。

5.1.1 等位基因水平的多態性KIR3DL1等位基因的多態性體現在序列組成的差異。截止2013年10月，IPD-KIR Database公布了78個KIR3DL1等位基因(http://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/stats.html，Realse 2.5.0)，其中KIR3DL1*024N為無效不表達等位基因。Gardiner等[4]在對19名個體(包括13個高加索人、2個印度人、2個非裔美國人、1個中國人和1個日本人)的研究中檢測到10種KIR3DL1等位基因。Jiang等[5]對100個非裔美國人的研究中檢測到30種KIR3DL1等位基因。隨著研究的不斷深入和檢測樣本量的增加，發現的KIR3DL1新等位基因的數量也將不斷增多。

5.1.2 群體水平的差異KIR3DL1等位基因的分布及其頻率具有地域性的特點，不同遺傳背景、不同種族之間差異也較大[6，7]。Norman等[3]對28個人群中的448個個體的KIR3DL1進行等位基因檢測，共檢出50種等位基因。并發現等位基因高表達組在細胞表面表達頻率由高到低的人群分布依次是：非洲人群＞東亞/東南亞人群＞南亞人群＞南美人群≈歐洲/中東人群；中表達組的表達頻率由高到低的人群分布依次是：東亞/東南亞人群＞歐洲/中東人群＞非洲人群＞南美人群≈南亞人群；不表達組的頻率由高到低的人群分布依次是：歐洲/中東人群＞南亞人群＞非洲人群＞南美人群≈東亞/東南亞人群。

不同的遺傳背景、不同種族之間KIR3DL1的檢出頻率也存在一定的差異。研究顯示中國漢族人群的3DL1檢出頻率為94.2%[8]，日本人的為97%[9]，越南人的為88%[10]，希臘人的為90%[11]，澳大利亞土著人的為55%[4]，巴勒斯坦人的為88%[12]，泰國人的為93%[10]，高加索人的為94～95.8%[13-15]，非裔美國人的為99%[5]。可見澳大利亞土著人的頻率偏低，其他研究人群的KIR3DL1檢出頻率比較接近。

Jiang等[5]對100個非裔美國人的研究中檢測到30種3DL1等位基因(包括7個新等位基因)，其中3DL1*01501和3DL1*01502最常見，

3DL1*00101、*00401、*00501、*007、*01701、*020、*022和*031較為常見，KIR3DL1*002、*00402、*008、*019和*029較少見。然而Norman等[16]對非洲人群的研究中未檢出上述較少見型的等位基因，該結果可能是由于非洲人群與歐裔美國人或土著美國人的通婚所造成的。在高加索人群中3DL1*001、*002、*004和*005是最常見的四種等位基因[16,17]，在日本人群中3DL1*01502最常見[18]，3DL1*01501僅在非洲人群中發現[19]。不同人群中KIR3DL1等位基因的種類及其頻率分布存在差異，同一等位基因在不同的人群中分布也存在差異。

5.2 表達水平的差異

5.2.1 轉錄水平的差異并非所有的KIR3DL1等位基因都具有相同的轉錄能力，McErlean等[20]對KIR3DL1轉錄能力進行研究分析，發現其mRNA表達水平由高到低依次為：KIR3DL1*007＞*004＞*00101＞*002＞*005＞*01502＞*008。KIR3DL1基因與KIR基因家族其它成員的5′側翼區序列同源性高達91.11%～99.16%[21]，但它們的功能卻有顯著的差異。Li等[22]首次證明啟動子的多態性影響KIR3DL1分子在NK細胞表面的表達頻率。啟動子核苷酸序列的多態性影響其與RNA聚合酶的親和力，從而影響轉錄起始的頻率。但是KIR3DL1/S1等位基因中的E2F、YY1和Sp1轉錄因子結合位點的單核苷酸多態性影響著這些等位基因的啟動子活性。E2F位點的改變(A→G)，可減弱該結合位點的結合作用，從而抑制正向啟動子的活性[23]。YY1能抑制正反向啟動子的活性，當其發生改變(T→C)時，則增強正反向啟動子的活性[24，25]。因此啟動子的多態性及轉錄因子結合位點的多態性決定轉錄水平。

5.2.2 在細胞膜上表達水平的差異Yawata等[26]研究發現KIR3DL1各等位基因在細胞膜上表達水平由高到低依次為：KIR3DL1*01502＞*020＞*001＞*007＞*005。Gardiner等[11，22-28]通過DX9和Z27 mAbs與NK細胞受體作用，根據檢測到的NK細胞表面的平均熒光強度將其受體分為四類：①低表達組：包括KIR3DL1*028和*053。②中表達組：KIR3DL1*005、*006、*007。③高表達組：KIR3DL1*001、*002、*003、*008、*015、*020。④不表達組：KIR3DL1*004(由于編碼D0結構域的第86位堿基和編碼D1結構域的第182位堿基的取代，導致了其在NK細胞表面幾乎不表達[27])。

5.2.3 介導的抑制作用的差異Yawata等[26]研究發現KIR3DL1各等位基因編碼的受體蛋白介導的抑制性作用強弱依次為：KIR3DL1*001>*005> *01502>*020>*007。

6 KIR的檢測方法

目前，常用的KIR檢測方法包括序列特異性引物-PCR(PCR-SSP)、流式磁珠序列特異性寡核苷酸探針(Flow-rSSO)雜交分析及測序分型技術(PCR-SBT)。KIR框架基因的測序分型，通常是采用二步法，首先用PCR-SSP或Flow-rSSO方法，鑒定受檢者KIR框架基因的有無，然后針對檢出了的KIR框架基因進行測序。因此，第一步KIR框架基因的有、無的鑒定，對KIR等位基因水平檢測結果的準確性至關重要。美國國立衛生研究院癌癥研究所建立的KIR PCR-SSP方法[29]與常規使用的商品化KIR PCR-SSP試劑盒的最大的不同之處在于：前者每個KIR模架基因采用2對KIR框架基因特異性的PCR引物進行擴增，以防止KIR框架基因的漏檢，減少假陰性的結果。Flow-rSSO商品化檢測試劑盒，簡化了KIR3DL1的分型操作過程，具有快速、高通量的特點。但KIR PCR-SSP和Flow-rSSO方法的局限性在于僅能檢測框架基因的有無，目前尚達不到等位基因水平的檢測。

PCR-SBT法為基因分型的國際金標準，可以鑒定等位基因，還可以發現新等位基因。國際上已有文獻報道[30]采用PCR-SBT法對KIR3DL1測序分型，但是擴增的目的序列較長(exon 1-3:3.4kb，exon 4:3.2 kb，exon 5-9:8.7 kb，exon 4-5:1.7kb)，對DNA的濃度和純度的要求高，耗費的時間長，對酶的活性和高保真性要求高。至今尚無商品化KIR測序分型試劑盒及配套的分析軟件應市，限制了KIR測序分型技術在骨髓和實體器官移植組織配型、惡性腫瘤、病毒感染性疾病等領域的廣泛應用。

7 KIR3DL1與疾病的關聯

KIR3DL1與艾滋病、乙肝、強直性脊柱炎、黑色素瘤等多種疾病相關，其中以KIR3DL1與HIV相關聯的文獻報道最多。

NK細胞是天然免疫系統重要的效應細胞，通過分泌細胞因子和細胞毒作用在機體抗HIV感染中發揮重要的防御作用[31]。近年來多項研究報道KIR3DL1與降低HIV-1病毒載量和延緩AIDS疾病進程有關。Martin等[32]通過對歐裔美國人及非裔美國人中的1500多例HIV攜帶者研究表明KIR3DL1的不同等位基因與其配體相互作用，在不同程度上明顯地影響了AIDS的病程進程和血清中HIV病毒載量。其中，KIR3DL1*004+Bw4在延緩AIDS的進程中起著重要作用，KIR3DL1其它等位基因在AIDS中保護作用的強度由強到弱依次是：KIR3DL1*h/*y+Bw4-80I>KIR3D L1*l/x+ Bw4-80I>Bw6/Bw6；KIR3DL1*h/*y+Bw4-80I在減緩AIDS的進程中起到保護作用；研究還發現3DL1*h/*y+Bw4-80I、KIR3DL1*004+Bw4、3DL1*h/ *y+B57、3DL1*l/*y+B27基因組合型能有效控制血清病毒載量，其中3DL1*h/*y+Bw4-80I和3DL1*h/ *y+B57基因組合型的HIV攜帶者的病毒載量明顯低于其它組，這兩種基因型在AIDS進程中起到重要的保護性作用。Lopez等[33]對88名贊比亞HIV-1感染者的研究顯示HLA-B*57可以延緩AIDs進展，抑制型KIR3DL1和HLA-B*57聯合表達對AIDs有顯著的保護作用。

Pelak等[34]通過對2102例歐裔HIV-1感染的患者進行研究，發現在KIR3DL1的配體存在時，KIR3DL1拷貝數的增加與病毒載量呈負相關；功能學研究發現具有多拷貝數KIR3DL1基因的NK細胞抑制HIV-1復制的能力更強。

以上學者從不同的方面對KIR3DL1與AIDS進行相關性研究，闡述了KIR3DL1在AIDS的疾病進程中起到的保護性作用，但是KIR3DL1基因與AIDS相關性的深層次分子機制，目前仍知之甚少。在全球范圍內艾滋病患者的基數大并在逐年增長，目前尚未找到治愈的方法，其嚴重危害著人類健康。進一步深入研究KIR-HLA受/配體復合物的分子作用機制，調節NK細胞的活性，對AIDS的預防和治療具有重要意義。

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R392.13

A

1674-1129(2014)04-0405-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.014

2014-02-11；

2014-04-23)

深圳市科技計劃重點項目(201101023)

陳達香，女，1991年1月,畢業學校：大連醫科大學，

醫學學士，醫學檢驗專業。

喻瓊，主任技師。