用血清游離輕鏈分析法檢測單克隆Y-病

王繼貴

(中南大學湘雅二醫院,湖南長沙410011)

.述評.

用血清游離輕鏈分析法檢測單克隆Y-病

王繼貴

(中南大學湘雅二醫院,湖南長沙410011)

單克隆免疫球蛋白游離輕鏈,對單克隆γ-病是一種重要的診斷標志物.150多年來一直沿用尿加熱試驗檢查Bence-Jones蛋白,以及用血清蛋白電泳及尿蛋白電泳檢查M蛋白區帶,診斷單克隆γ-病.這些方法敏感度低,特異性差,遠遠不能滿足該病診斷和分類的要求.近十年來,發展了血清游離輕鏈的自動化免疫試驗,能獨立地測定κ鏈、λ鏈、κ/λ比率和游離輕鏈總量,大大地提高了單克隆γ-病的診斷、分類和治療監測.本綜述將討論用于測定游離輕鏈的不同實驗方法,并介紹臨床應用的評價.

游離輕鏈;單克隆γ-病;多發性骨髓瘤

單克隆免疫球蛋白游離輕鏈(Free light chains, FLC)對單克隆γ-病(Monoclonal gammopathies,MG)是一個重要的診斷標志物.150多年來,尿中出現本一周氏蛋白(Bence-Jones protein,BJP)已用作單克隆FLC產生的關鍵指征.然而,最近10年,隨著可利用的自動化免疫試驗的發展,獨立地測定血清κ和λ FLC,大大地促進了MG的診斷和治療監測.血清FLCs(serum free light chains,sFLCs),通過腎小球迅速被清除,半衰期為2~6h.sFLCs濃度是一個更準確的代表產生的水平,當多克隆免疫球蛋白產生增加和/或腎損傷時,κ和λ sFLC兩者的濃度可增加30~40倍,然而,κ與λ的相對濃度(即κ/λ比率)保持不變,或僅輕微地增加.相反,在漿細胞惡液質(Plasma cell dyscrasias,PCD)的病人中,一種FLC型的單克隆產生過量,出現一種異常的κ/λ比率,提供一種克隆形成能力的數學指征.對于單克隆γ-病,sFLC試驗對于診斷、預后及監測這類病人的臨床重要性,現在已完全確定,在國際指南中[1,2]已得到公認.

1 測定單克隆FLC的方法

過篩MG的實驗室方法,傳統上是用血清蛋白電泳(Serum protein electrophoresis,SPE)和尿蛋白電泳(Urine protein electrophoresis,UPE).單克隆蛋白(M-蛋白)在電泳凝膠上移動成為一條不相關聯的區帶,在光密度計上掃描時出現一個單一的峰,它對M-蛋白的量提供一個半定量數值.繼用SPE鑒定M-蛋白之后,需用血清免疫固定電泳(Serum immunofixation electrophoresis,sIFE)以證實克隆形成能力和隨后的分型.SPE的主要缺點是敏感度低,不能檢測低水平的單克隆蛋白,sIFE更敏感,大約比SPE敏感10倍[3].可以測定用SPE檢測不出的單克隆蛋白.然而,寡分泌病(Oligosecretory diseases)病人,如輕鏈多發性骨髓瘤(light chain multiple myeloma,LCMM)、AL-淀粉樣變性和輕鏈沉積病(light chain deposition disease,LCDD),這類病人單克隆FLCs水平,用SPE或sIFE常常不足以檢出.在150多年期間,尿中單克隆FLCs(BJP)對于多發性骨髓瘤(MM)已是一個重要的診斷標志物, UPE和尿IFE(uIFE)對于檢測單克隆FLCs比SPE更敏感,可檢測尿中水平低于20mg/L的FLCs.盡管UPE和uIFE比SPE敏感,前兩個方法仍然有它們的技術和實用性限制[3].首先,血清中FLC水平必須顯著增加,尿中方可出現BJP,血清中低水平的單克隆FLC,尿中可能檢不出,尿BJP試驗不能直接反映基礎的單克隆FLC的產生率;第二,尿分析需收集24h尿標本,成批檢查,不能用隨機尿,隨機尿的變動性在5%~59%之間,因此延遲了報告結果的時間,第三個可能的限制是基于尿測定鑒別單克隆FLCs是主觀的解釋電泳結果,檢測低水平的單克隆FLCs是特別困難的.由于尿分析的突出限制,國際指南[2]現在推薦在診斷MG時用血清FLC試驗代替尿分析.

1.1 用于血清單克隆FLC檢查的免疫試驗在2001年,自動化的sFLC免疫試驗(Freelite,Binding Site,UK)使能在常規的實驗室中進行血清單克隆FLC的定量測定.sFLC免疫試驗提供一種獨立地測定κ和λ FLC,且可計算κ/λ sFLC比率,提供一個克隆形成能力的敏感的數學指征.在漿細胞惡液質(Plasma cell dyscrasias)的病人中,由于頻繁地骨髓交替抑制FLC,導致僅一型FLC過量產生,常常出現高度異常的κ/λ比率.這個試驗是乳膠增強免疫試驗,可測定低濃度的FLC,對κ和λ FLCs分別為1.5mg/L和3mg/L,遠低于正常血清濃度.

Katzmann等[4]用自動化的免疫試驗測定了游離κ和游離λ免疫球蛋白輕鏈血清參考區間,樣本來自21~90歲健康人.FLC κ/λ比率參考區間為:0.26~1.65.FLC95%參考區間分別為:κ FLC是3.3~19.4 mg/L,λ FLC為5.7~26.3mg/L.研究認為用比濁法定量測定單克隆FLC比IFE更敏感,可補充IFE的不足,且能在輕鏈病人中定量測定FLCs,這些病人血清或尿中沒有可檢出的M-蛋白.

sFLC免疫試驗使用的抗體有高度的特異性和親和力,用于檢測同類抗原的試驗,單克隆抗體(MAbs)是很成功的.然而,一種可靠地檢測整個范圍的單克隆FLC受到限制,由于FLC分子的異質性,一種Mab將只能識別單一的抗原決定基,個別的Mabs將不能檢測由單克隆γ-病病人產生的不同范圍的單克隆FLC,因此,Freelite試驗是用來自于綿羊的多克隆抗體發展的,這類試驗能識別各種FLC抗原決定基,包括由單克隆γ-病病人產生的不同病理變化的單克隆FLC.

已發展了幾個基于Mab的FLC免疫試驗, Campbell等[5]設計了一個高敏免疫試驗,用單克隆抗體同時測定血清和尿中κ和λ免疫球蛋白輕鏈.用特異的鼠抗人FLC單克隆抗體(MAbs),抗κ和抗λ FLC mabs分別共價結合到聚苯乙烯小珠上用于試驗,方法靈敏,敏感度<1mg/L;特異,mabs顯示沒有交叉反應,線性范圍寬,可達437.5mg/L;且可防止抗原過剩的影響.在高水平的FLC時,本法與FreeliteTM良好地相關,對于健康人群FLC標本, MAbs試驗能識別血清中所有單克隆FLC.需要進一步的臨床研究,以證實在不同的單克隆疾病時的實用效力.

Velthuis等[6]設計了一個N乳膠FLC新的單克隆高效試驗,用于測定游離輕鏈κ和λ.此試驗基于用單克隆抗體乳膠增強免疫比濁法測定血清或EDTA抗凝血漿及肝素鋰血漿中FLC κ和λ.用于Siemens BNTM方法系統.從369例健康人標本中測定了FLC參考范圍,FLCκ輕鏈為6.7~22.4mg/ L,FLC λ輕鏈為8.3~27mg/L,κ/λ比率為0.3~1.56.批間精密度良好,在4%和7%之間變動.同FreeliteTM方法比較,相關良好,對于FLC κ、λ和κ/ λ比率相關系數r分別為0.94、0.77和0.73.一致性率分別為99.2%、94.2%和95%.研究認為:N乳膠FLC試驗精密度良好,不受Hook效應的影響,與FreeliteTM法有良好的一致性.需要進一步地研究以揭示新的FLC試驗的臨床價值.

Lock等[7]采用多中心研究比較了上述兩類技術(Freelite Binding Site,UK和N乳膠FLC試驗, Siemens系統)測定游離輕鏈的性能,在四個常規實驗室,按照制造商的指令,對這兩種試劑合進行了比較.采用313例血清標本比較游離κ鏈,324例血清標本比較游離λ鏈.結果發現,兩法相關不好者,κ鏈有81%,λ鏈有74%.有5%的樣本在這些實驗中顯著地不一致.研究認為:這些實驗在臨床實踐中結果很不相同,不能互換,特別是對治療反應的監測,需作大量的臨床研究,以證實它們的臨床價值.

1.2 在診斷時對sFLC試驗結果的解釋對于sFLC分析,應測定κ和λ兩種FLCs,再計算κ/λ比率.若結果處于已發表的參考范圍[4]之外時,結果應考慮為異常.再結合血清SPE和IFE測定結果及臨床信息,即不難作出診斷[8].如果血清κ FLC,λ FLC和κ/λ比率都在正常范圍內,且血清SPE也是正常的,此病人不可能有MG.相反,異常的κ/λ比率和κ或λ FLC一起增加,則支持MG的診斷,需要進一步地研究.臨界結果需小心地解釋,臨界異常的κ/λ比率偶爾見于多克隆FLC增加的病人如腎損傷,多克隆高γ-球蛋白血癥及感染和炎性疾病的病人[9].

2 FLC列入實驗診斷方法用于診斷MG

許多研究[3,8,9]都已證實sFLC試驗對于廣譜單克隆漿細胞病的診斷價值,包括自無癥狀的未明確意義的單克隆γ-病(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)和郁結性多發性骨髓瘤(Smouldering multiple myeloma,SMM)到有癥狀的疾病:多發性骨髓瘤(MM)、巨球蛋白血癥(WM)、AL淀粉樣變性、LCDD、孤立性漿細胞瘤(Solitary plasmacytoma)和POEMS (polyneuropathy,organomegaly,endocrinopathy,M protein and Skin,POEMS,多神經病、器官巨大癥、內分泌病、M蛋白和皮膚病變綜合征).許多研究都評價了用sFLC試驗與其他實驗室檢查一起作為最初診斷的一部分,過篩疑有MG的病人.

Katzmann等[10]領導的專題小組最廣泛的研究了1877例疑有MG病人的過篩.該研究組采用SPE、UPE、sIFE、uIFE和sFLC 5種技術用于過篩,在30天診斷時間內全部病人均得出結果.當SPE和sFLC聯合時,有58例病人為陰性過篩(其中44例為MGUS、7例POEMS、5例AL淀粉樣變性、1例漿細胞瘤和1例SMM).然而,所有的MM、WM和LCDD病人都被檢出.而且,增加sFLC試驗鑒別出30例病人(23例AL淀粉樣變性、6例MM和1例LCDD),這30例病人用傳統的一組血清和尿試驗都未檢查出.

基于已發表的資料,國際骨髓瘤工作組[2]結論:在有關疾病存在的背景下,過篩MM,對于診斷除AL淀粉樣變性外,sFLC試驗和SPE及sIFE聯合,產生很高的敏感度,不需要24h尿研究.

3 sFLC試驗對于MG的診斷敏感度

sFLC κ/λ比率頻繁地異常可預期病人有MM包括LCMM、非分泌型MM(nonsecretory MM,NSMM)和完整免疫球蛋白MM(intact immunoglobulin MM,IIMM)以及AL淀粉樣變性.

3.1 輕鏈多發性骨髓瘤LCMM占所有MM病例約20%,用血清或尿中出現FLCs進行診斷.在缺乏完整的單克隆免疫球蛋白時,僅用SPE過篩, LCMM病例超過40%不能檢出[11],可能同沒有檢測尿中單克隆FLC有關.

3.2 非分泌型多發性骨髓瘤NSMM占所有MM病例的1%~5%,其特征是用IFE檢查血清和尿中缺乏單克隆蛋白.然而,某些NSMM病人產生單克隆免疫球蛋白,雖然在血清中不能檢出,在骨髓漿細胞中用免疫組化法可以檢出.僅有10%~15% NSMM病人是真正的非分泌型,它們之中漿細胞的腫瘤細胞不含可檢出的免疫球蛋白.

Middela等[12]報告NSMM在診斷上有許多困難,測定sFLC在診斷許多NSMM病人時,對病人已產生了明顯的益處,避免了延誤診斷.因此, sFLC免疫試驗被國際骨髓工作組(International Myeloma Workshop Group,IMWG)推薦用于SNMM的診斷[2].

3.3 完整免疫球蛋白多發性骨髓瘤IIMM占所有MM病例約80%,其特征是此型MM分泌單克隆完整的免疫球蛋白,在診斷這型病人時,約95%IIMM病人也分泌單克隆FLCs,sFLC分析用于疾病的監測和預后.因FLCs血清半衰期短,使得它們成為克隆病的有用標志物,監測單克隆sFLC水平比完整免疫球蛋白水平能提供更準確地評價治療反應,因后者半衰期較長.

重要的是IIMM病人疾病再度惡化時的血清學診斷不能僅依賴于測定單克隆完整的免疫球蛋白,在MM時對克隆演變的認識正在不斷增加,且同還在產生的單克隆蛋白的變化有關.例如,IIMM病人在診斷時可能是再度惡化,可能僅產生單克隆FLCs[13].由于高濃度FLC,使病人傾向于發生腎并發癥,在病人監測期間,定期評價sFLCs,能提供早期腎損害的指征和腎衰竭的任何危險性.根據涉及在MM中復雜的克隆動力學,最好同時測定單克隆完整的免疫球蛋白和sFLCs.

3.4 AL淀粉樣變性和輕鏈沉積病AL淀粉樣變性和LCDD是單克隆輕鏈在細胞外沉淀所引起的兩種疾病.它使多器官的結構和功能紊亂.在AL淀粉樣變性時,輕鏈片段最普通的是λ型,以不溶性淀粉原纖維聚積,常常影響腎臟和心臟.最常參與LCDD中的單克隆輕鏈是κ型,且沉淀在腎臟和各種其他器官細胞的基底膜上.

Palladini等[14]報告:在診斷AL淀粉樣變性時,需要聯合血清游離輕鏈試驗和血清及尿IFE.用組織活檢和免疫組化證實淀粉體沉淀在組織.結果顯示,聯合血清和尿IFE同血清FLC試驗和κ/λ比率診斷敏感度為100%,認為鑒別促淀粉樣變輕鏈,不能僅依賴單一的試驗,需要聯合FLC試驗和血清及尿IFE.

Nasr等[15]報告了64例腎單克隆免疫球蛋沉積病(monoclonal immunoglobulin deposition disease, MIDD),其中51例為LCDD,7例為重鏈沉積病,6例為輕鏈和重鏈沉積病.實驗室檢查62例病人血清蛋白異常,47例SPE檢出M-蛋白(73%),51例病人游離輕鏈比率異常.臨床表現有腎機能不全、蛋白尿、血尿和高血壓.研究顯示:與輕鏈淀粉樣變性和輕鏈管型腎病比較,MIDD病人通常比較年輕,23例病人≤50歲(36%).

IMWG指南[2]中推薦用sFLC分析同sIFE和uIFE聯合測定過篩AL淀粉樣變性和LCDD.

4 血清FLC用于早期檢測骨髓瘤腎病

在MM病人中,骨髓瘤腎病是嚴重的、不可逆的腎衰竭的重要原因.單克隆FLCs能引起許多腎內不同的病理改變,它依次能導致不同的臨床表現,其中最常見的是急性腎損傷(acute kidney injury,AKI),腎小管間質損害是高濃度的循環單克隆FLCs的直接后果.續發于腎小管間質損害的病理性管型腎病,是在腎單位內的遠曲小管中形成蠟樣管型,由于FLC同Tamm-Horsfall蛋白聚集引起間質炎癥和纖維化,在大約90%依賴透析的MM病人中都可發現、早期診斷是十分重要的,可積極治療以使迅速降低MM腎病病人血中的FLC濃度,改善病人的生存質量[16].因此,早期過篩測定FLC,使能迅速診斷骨髓瘤腎病,確定AKI的原因,最近,已被國際腎病和MG研究組推薦[17].

5 展望

過去150多年期間,尿中出現BJP蛋白已用作單克隆FLC產生的關鍵指征,用來診斷MM,然而,最近10年,隨著自動化FLC免疫試驗的發展,獨立地測定血清κ和λ FLC,大大地促進了MG的診斷和治療監測.

IMWG推薦血清FLC分析用于MM及有關疾病的診斷和分型,特別是由于AL淀粉樣變性、LCMM和NSMM的診斷和鑒別,受到廣泛的關注.最近,國際腎病和MG研究組推薦用血清FLC試驗快速診斷骨髓瘤腎病過篩AKI,收到良好的效果.

血清FLC免疫試驗目前有兩個試驗系統,一是用FLC多克隆抗體的Freelite法,另一個是用FLC單克隆抗體的Siemes系統,兩個方法測定結果不完全一致,需要大量的臨床研究以評價它們的臨床價值.

[1]Dimopoulos M,Kyle R,Fermand JP,et al.Consensus recommendations for standard investigative workup:report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 3[J].Blood,2011,117(18): 4701-4705.

[2]Dispenzieri A,Kyle R,Merlini G,et al.International Myeloma Working Group guidelines for serum free light chain analysis in multiple myeloma and related disordes[J].Leukemia,2009,23(2): 215-224.

[3]Holding S,Spradbery D,Hoole R,et al.Use of serum free light chain analysis and urine protein electrophoresis for detection of monoclonal gammopathies[J].Clin Chem Lab Med 2011,49(1):83-88.

[4]Katzmann JA,Clark RJ,Abraham RS,et al.Serum reference intervals and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains:relative sensitivity for detection of monoclonal light chains[J].Clin Chem,2002,48(9):1437-1444.

[5]Campbell JP,Cobbold M,Wang Y,et al.Development of a highlysensitive multi-plex assay using monoclonal antibodies for the simultaneous measurement of kappa and lambda immunoglobulin free light chains in serum and urine[J].J Immunol Methods, 2013,391(1-2):1-13.

[6]te Velthuis H,Knop I,Stam P,et al.N Latex FLC-new monoclonal high-performance assays for the determination of free light chain kappa and lambda[J].Clin Chem Lab Med,2011,49(8):1323-1332.

[7]Lock RJ,Saleem R,Roberts EG,et al.A multicentre study comparing two methods for serum free light chain analysis[J].Ann Clin Biochem,2013,50(pt3):255-261.

[8]Vermeersch P,Van Hoovels L,Delforge M,et al.Diagnostic performance of serum free light chain measurement in patients suspected of a monoclonal B-cell disorder[J].Br J Haematol,2008,143(4): 496-502.

[9]Piehler AP,Gulbrandsen N,Kierulf P,et al Quantitation of serum free light chains in combination with protein electrophoresis and clinical information for diagnosing multiple myeloma in a general hospital population[J].Clin Chem,2008,54(11):1823-1830.

[10]Katzmann JA,Kyle RA,Benson J,et al.Screening panels for detection of monoclonal gammopathies[J].Clin Chem,2009,55(8): 1517-1522.

[11]Abraham RS,Clark RJ,Bryant CC,et al.Correlation of serum immunoglobulin free light chain quantification with urinary Bence Jones protein in light chain myeloma[J].Clin Chem,2002,48(4): 655-657.

[12]Middela S,Kanse P.Nonsecretory myeloma[J].Indian J Orthop 2009,43(4):408-411.

[13]Zamarin D,Giralt S,Landau H,et al.Patterns of relaps and progression in multiple myeloma patients after auto-SCT:implications for patients'monitoring after traasplantation[J].Bone Marrow Transplant,2013,48(3):419-424.

[14]Panadini G,Russo P,Bosoni T,et al.Identification of amyloidogenic light chains requires the combination of serum free light chain assay with immunofixation of serum and urine[J].Clin Chem,2009,55(3):499-504.

[15]Nasr SH,Valeri AM,Cornell LD,et al.Renal monoclonal immunoglobulin deposition disease:a report of 64 patients from single institution[J].Clin J Am Soc Nephrol,2012,7(2):213-239.

[16]Hutchison CA,Cockwell P,Stringer S,et al.Early reduction of serum free light chains associated with renal recovery in myeloma kidney[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(6):1129-1136.

[17]Hutchison CA,Batuman V,Behrens J,et al.The pathogenesis and diagnosis of acute kidney injury in multiple myeloma[J].Nat Rev Nephrol,2011,8(1):43-51.

R446.62,R730.263,R446.11+2

A

1674-1129(2014)03-0233-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.001

2014-02-25;

2014-03-20)

王繼貴,男,1937年生,中南大學湘雅二醫院檢驗科原主任,主任檢驗師,主要研究方向為臨床生物化學.