莽草酸的制備及其生物學功能研究進展

何邵平，禹琪芳，段杰林，肖定福，賀建華*

（1.湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，長沙 410125）

莽草酸又名毒八角酸，是一種具有天然生物活性的含手性碳化合物[1]。是自然界中存在的一種重要有機酸，也是植物代謝過程的中間產物，在木蘭科八角屬植物茴香（Illicium verum）的果實中含量較高。

現代藥理學研究證明，莽草酸及其衍生物具有抗菌、抗腫瘤、抗血栓及腦缺血、抗炎、抗病毒等多種生物活性。目前我國在臨床上將該化合物鑒定為合成治療H5N1亞型高致病性禽流感唯一有效藥物“達菲”的關鍵中間體，這使得莽草酸的開發價值大幅提高[2]。對于禽流感發生頻率的增多，其作為合成抗禽流感藥“達菲”的主要原料，具有廣闊的研究前景。本文結合國內外研究進展從莽草酸的來源、提取分離純化工藝、制備途徑、生物學功能等進行詳細闡述。

1 莽草酸的理化性質及主要植物性來源

莽草酸是一種白色粉末晶體，分子式C7H10O5，相對分子質量為174.15，化學結構為3，4，5-三羥基-1-環己烯-1-羧酸，熔點為185～187℃，難溶于氯仿、苯和石油醚等有機溶劑，易溶于水，在水中的溶解度為180 g·L-1。由于分子結構中含3個羥基，一個羧基，一個雙鍵，因而莽草酸可以成酯，也可以成鹽。莽草酸是一種重要的生物代謝中間體，可以作為許多生物堿、芳香氨基酸以及吲哚衍生物等合成原料[3]。莽草酸是由Eykman在1885年首次從八角科植物的干燥成熟果實中提取得到，隨后Sieb和Zucc將其命名為Shikimic acid[4]。研究發現，莽草酸廣泛存在于各種植物組織中，如銀杏科植物銀杏葉和內皮、桃金娘科植物檸檬桉的樹葉、使君子科植物訶子的果實和樹葉、傘形科植物茴香的莖和葉、?？茻o花果的果實、八角茴香的果實。其中以八角茴香中莽草酸的含量最高（約10%）[5]。

2 莽草酸的制備方法

2.1 從植物中提取

莽草酸是高等植物經莽草酸代謝途徑的產物，因而很多高等植物都能生產莽草酸，只是量不同而已，能提取分離莽草酸的植物有八角茴香、金絲桃、毒箭木、小飯團、山海螺、楓香、雞蛋參、馬尾松松針等[6]。根據莽草酸的溶解性質以及現代提取分離新技術大量的運用，建立了許多莽草酸的提取方法包括常規溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助萃取、膜分離法提取、分子印跡技術提取等。

謝濟遠等采用水蒸汽蒸餾法提取了濕地松松針中揮發油和莽草酸，用高效液相色譜儀測定提取物中莽草酸的含量，通過單因素實驗和正交實驗，確定水蒸汽蒸餾法提取莽草酸最佳工藝條件是：松針粒度為40目、料液比為1∶12、浸泡時間為6 h、提取時間為4 h，莽草酸的得率（提取液中莽草酸質量/八角茴香質量）為1.32%[7]。林於等通過采用水提醇沉、大孔吸附樹脂脫色、離子交換樹脂分離等方法，從馬尾松中分離純化莽草酸，所得莽草酸含量高達96%，得率為0.78%[8]。Xie等用乙醇浸提濕地松松針中的莽草酸，研究不同水平乙醇濃度、料液比、浸提溫度、提取時間及浸泡時間對莽草酸提取率的影響，通過單因素和正交實驗，確定影響莽草酸提取率的因素主次順序是：乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間；乙醇浸提法提取莽草酸的最佳工藝為：乙醇濃度為60%，提取溫度為75℃，料液比為1∶25，提取時間為2.5 h，在該條件下，莽草酸的得率為1.49%[9]。逯家輝等也通過采用響應面法優化超聲波提取方法，從八角茴香中提取莽草酸的得率驗證值為8.21%，與預測值的相對誤差為0.45%[10]。同樣劉潔等利用超聲波方法，通過單因素試驗采用二次回歸通用旋轉組合設計試驗方法建立數學模型，提取率（提取液中莽草酸質量/八角茴香中莽草酸總質量）達99.3%，滿足生產需要，并得出了提取莽草酸的優化工藝為：時間46min，溫度83℃，液料比12∶1，粒度60目，重復兩次[11]。林海祿等也利用超聲波提取法與傳統提取作了比較，超聲提取40min，得率為2.89%；熱回流提取180min，得率為2.38%[12]。姚菁華等為優化八角茴香中莽草酸的微波提取工藝研究各自變量及其交互作用對莽草酸提取的影響，采用響應面分析軟件，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型，在其條件下，平均得率為3.03%[13]。林海祿等與丁雷濤等也都采用微波輔助分別從八角茴香和松針中提取了預期量的莽草酸[14-15]。此外，周媛媛等利用分子印跡技術（莽草酸模板分子∶丙烯酰胺功能單體∶乙二醇二甲基丙烯酸酯交聯劑=1∶8∶8），以偶氮二異丁腈為引發劑，合成莽草酸分子印跡聚合物（MIPs）其效果最佳[16]。根據莽草酸吸附等溫線，印跡效果非常明顯，MIP吸附容量是非分子印跡（NIP）3.76倍，可用于提取莽草酸。因此，提取莽草酸時，傳統的分離方法具有提取效果差、收率低等缺點。而超聲波提取具有收率較高、生產周期短，有效成分基本不被破壞等優點；微波輔助提取法具有設備簡單、操作時間短、適用范圍廣、重現性好、溶劑消耗量少，且提取率較高、速度快、污染小等一系列優點，對提取天然產物有效成分具有廣闊應用前景；MIPs由于具有顯著的選擇性吸附能力，現被廣泛的應用于各種分離過程中，因此，采用分子印跡技術研制莽草酸特異性選擇性分子印跡聚合物有重要的應用價值。

2.2 化學合成

20世紀以前，莽草酸及其衍生物的合成方法主要有：碳氫化合物轉化法、奎寧酸轉化法、Diels.Alder反應和逆Diels.Alder反應[17]。碳氫化合物轉化法主要以手性碳結構單元（1R，5R，7S）-7-[（二甲基叔丁基硅氧基）甲基]-6，8-二氧二環[3.2.1]辛-3-烯-2-酮和乙烯溴化鎂經過一系列氧化還原反應，最后水解生成莽草酸，莽草酸總收率可達7.8%?？鼘幩徂D化法則是以奎寧酸衍生物和2，2-二甲基丙烷作為原料合成，總收率達62%[5]。而逆Diels.Alder合成法以環戊二烯和苯醌為原料，初始合成莽草酸，總收率最高可達41%（碳源為基礎）。之后在許多學者相繼發表有關非手性有機原料代替莽草酸來合成達菲的方法[18-19]。

2.3 微生物代謝合成

目前，利用工程菌發酵生產莽草酸的研究多是采用基因工程改造的大腸埃希菌。通過中止莽草酸循環中產生莽草酸下游途徑，從而達到莽草酸積累的目的。大腸埃希菌具有兩個莽草酸激酶，分別為aroK編碼的莽草酸激酶Ⅰ和aroL編碼的莽草酸激酶Ⅱ。試驗發現，aroL編碼的莽草酸激酶Ⅰ的Km比莽草酸激酶Ⅱ的大約100倍。只有當底物莽草酸達到一定濃度后，激酶Ⅰ才具有生物活性，因此，在大腸埃希菌中催化此反應中激酶Ⅱ起主要作用[20]。Fu等通過敲除aroL基因，其突變株能夠有效積累莽草酸提高產量157%[21]。李明明等利用Red-Xer重組系統連續刪除了野生型大腸桿菌CICIM B0013的莽草酸激酶基因（aroL、aroK），葡萄糖磷酸轉移酶系統（PTS）的關鍵組分EIICBglc的編碼基因（ptsG）以及奎寧酸/莽草酸脫氫酶基因（ydiB），發酵結果表明，4個基因缺失的大腸桿菌代謝工程菌生產莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍[22]。汪華等與陳凱等也進行了相關報道，得到了類似的結論[23-24]。

2.4 其他合成途徑

Bresnahan等研究表明，除草劑草甘膦能干擾莽草酸的正常代謝途徑，主要是由于草甘膦被小麥吸收后被轉移到植物的活性生長區內，通過抑制5-烯醇丙酮酸-莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）合成，而發揮作用[25]。有研究表明，EPSPS是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等蛋白質合成的關鍵酶，由于EPSPS的合成被抑制，因而導致莽草酸的大量積累。

不同途徑獲得的莽草酸各有不同的特點。從植物中提取莽草酸是目前主要來源之一，但是主要提取植物八角茴香受到地域限制，生產資源有限，不是今后發展主要渠道。因此，合適的化學合成途徑和生物代謝合成途徑將成為發展重點。另外，在以往的報道中只有某一途徑獲得的莽草酸具有生物學功效，對不同途徑獲得的莽草酸效價對比性研究幾乎很少，有待進一步研究。

3 莽草酸的生物學功能

3.1 抗菌、抗腫瘤

研究表明，莽草酸衍生物具有抗菌、抗腫瘤作用。以莽草酸甲酯為底物合成的乙二醛酶Ⅰ抑制劑類似物對海拉細胞株和埃希利腹水癌具有明顯抑制作用，且能延長接種白血病細胞L1210小鼠的存活時間，而對機體自身的毒性相對較低，其抑制機理可能與硫氫化物的反應有關。孫快麟等也得到了類似的結果，并證實莽草酸衍生物二霉素的類似物，與二霉素有著類似的體外抑制白血病細胞L1210的功能[26]。

3.2 抗血栓形成

莽草酸對心血管系統的保護作用主要是通過抑制血小板聚集和抗血栓的形成。馬怡等報道表明，莽草酸具有顯著抗血栓作用以及抑制動、靜脈血栓及腦血栓的形成，通過進一步研究發現，莽草酸主要是通過影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集和凝血系統，進而發揮其抗血栓形成的作用[27]。王宏濤等也得到類似結論，研究發現，異亞丙基莽草酸（ISA）具有顯著抑制血栓形成功能，這可能與其抗血小板聚集作用有關[28]。陳驍熠等采用體外給藥法觀察馬尾松中的莽草酸對Collagen和ADP誘導的血小板聚集的影響，結果可見，馬尾松中的莽草酸有很好的抑制體外Collagen、ADP誘導的血小板聚集，且劑量和作用呈現一定的正相關性[29]。這說明馬尾松中莽草酸能抑制血小板聚集，具有抗凝血作用，可防止血栓形成。

3.3 抗腦缺血

莽草酸及其衍生物抗腦缺血的功能主要通過抑制血小板聚集和血栓形成以及抑制血管內皮細胞的活化，從而發揮抗腦缺血的作用。馬怡等探討莽草酸對中腦動脈形成血栓后病灶腦缺血影響結果表明，其能夠顯著減少小鼠中腦動脈血栓的形成[27]。鐘兆忠等研究表明，三乙酰莽草酸（TSA）通過降低腦缺血后的紅細胞聚集程度以及抑制血小板聚集，從而促進腦血液微循環，另外，TSA還可影響P-選擇素的表達，抑制腦缺血再灌注和凝血酶引起的血小板與中性粒細胞的黏附，從而發揮其抗腦缺血的功能[30]。王宏濤等在研究ISA對大腦中動脈栓塞模型大鼠腦組織自由基代謝作用時發現，ISA能顯著提高腦組織中SOD和GSH-px的活力，顯著降低了MAD的水平，提示ISA可能是通過減少自由基對腦組織損傷而達到保護腦組織缺血性損傷作用[28]。

3.4 抗炎鎮痛

邢建峰等研究發現，ISA不僅可以抑制炎癥早期的滲和水腫，也可抑制炎癥晚期的組織增生以及肉芽組織的形成，具有顯著的抗炎癥功能。另外ISA能夠影響細胞轉錄因子STAT1、STAT3、NF-kB的表達[31]。ISA通過下調轉錄因子NF-kB的活性，抑制炎癥因子（IL-1β、TNF-α、INF-γ）的表達，從而起到抗炎癥的效果[32]。莽草酸具有一定的鎮痛作用，其主要通過影響動物的神經中樞，從而達到抑制效果，具體檢測指標為動物扭體的頻率。林潔等采用扭體法和溫浴法試驗發現，腹腔注射莽草酸溶液能顯著減少小鼠扭體次數，這表明莽草酸對小鼠具有明顯的鎮痛作用[36]。

3.5 抗禽流感作用

瑞士羅氏公司生產的神經氨酸酶抑制劑“達菲”，對抗流感病毒具有顯著抑制作用，試驗研究表明，其對禽流感病毒H5N1和H9N2具有顯著的抑制作用，而莽草酸是合成“達菲”的重要原料[34]。其作用機理為莽草酸結構中的親脂性基團與流感病毒的神經氨酸酶的疏水部分結合，使病毒的神經氨酸酶失去分解被污染細胞表面唾液酸的能力，阻斷了病毒顆粒向周圍細胞的擴散，從而抑制流感病毒的繼續傳播。

4 展 望

莽草酸是一種比較有前景的新型天然藥物，其來源廣泛。莽草酸作為合成抗禽流感藥“達菲”的重要原料，也受到許多學者的關注，因此尋找高產率、低成本的制備途徑是所有研究者努力的方向。目前，對莽草酸及其衍生物等的研究主要集中在抗血栓、抗炎、抗病毒方面，而對于其抗腫瘤作用以及機制的研究鮮為報道。因此，在莽草酸抗腫瘤及其分子水平作用機制方面可以更為深入的研究，對其進行很好的開發利用，為社會做出更大的貢獻。此外，如果將莽草酸作為一種添加劑適用于家畜生產的有效性需進一步研究。

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