反芻動物飼料中牛羊源性成分檢測污染控制及應對措施

宮玲玲 李俊玲 李會榮 張 蕓 強 莉 張 瑋（山東省飼料質量檢驗所 山東 濟南 250022）

反芻動物飼料中牛羊源性成分檢測污染控制及應對措施

宮玲玲 李俊玲 李會榮 張 蕓 強 莉 張 瑋（山東省飼料質量檢驗所 山東 濟南 250022）

為打擊反芻動物飼料中添加牛羊源性成分的違法行為，切斷瘋牛病通過飼料的傳播途徑，防范瘋牛病在我國的發生，確保牛羊安全和食品安全，對芻動物飼料進行牛羊源性成分的檢測。然而牛羊源性成分檢測步驟繁多，檢測過程復雜，做好污染控制對檢測成敗至關重要。根據多年來從事牛羊源性成分檢測總結的經驗和教訓，下面從以下幾個方面介紹避免交叉污染的控制措施以及出現污染后的應對措施。

1 反芻動物飼料中牛羊源性成分檢測交叉污染的控制

1.1 合理分隔試驗區 （1）樣品處理區(樣品粉碎區和稱樣區)；（2）核酸提取區；（3）PCR反應液制備區；（4）擴增區；（5）PCR產物鑒定區。其試驗用品及取樣槍應專用。

1.2 槍頭、離心管等消毒滅菌 槍頭、離心管、配反應體系所用的水等用前經過高溫滅菌，一般120℃ 30min即可。注意不要和微生物共用滅菌鍋，以免被培養基中的牛肉膏污染。

1.3 樣品的粉碎 用較小的粉碎機粉碎反芻動物飼料，便于清理。粉碎機放置在能排風的環境中。粉碎機先粉碎玉米碴或麩皮4～5遍，再粉碎經4分法分取的樣品3遍棄掉，收集第4遍粉碎的全部樣品混勻裝袋備用。注意粉碎完每一遍都要用氣槍、毛刷將粉碎機清理干凈。一份樣品使用一套工具，包括手套，可使用廢棄報紙代替塑料布，用后廢棄。

1.4 稱樣 稱樣時一個樣品用一把勺子，也可用稱樣紙折成小條代替勺子。稱樣時戴手套，如樣品沾到手套上要及時更換。

1.5 核酸提取 提取液分裝成小包裝。加提取液時一樣一槍頭，避免交叉污染。

1.6 PCR反應液制備 在配制過程中，注意加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染，所有的PCR試劑都應小量分裝，避免反復凍融影響效果。

1.7 擴增 牛羊源性成分設立陽性和陰性對照。（1）設立牛羊源性成分陽性和陰性對照和試劑對照。陽性對照以能出現擴增條帶的最低量的標準核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照；（2）牛羊源性成分陰性對照。包括：①樣品對照：被檢的樣品是飼料就用鑒定后的陰性飼料作對照；②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

1.8 牛羊源性成分PCR產物鑒定 PCR產物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。在電泳上樣時，擴增后的PCR管蓋小心開啟。PCR產物鑒定時使用的EB(溴化乙錠)是一種致癌劑，對操作者和環境都有一定的污染。為了操作者的健康和避免對環境造成污染，選用EB替代物，如Goldview等試劑。我們在試驗過程中做了多次EB及EB替代物的比對試驗，表明二者的染色效果基本相同。

2 反芻動物飼料中牛羊源性成分檢測污染后的應對措施

反芻動物飼料中牛羊源性成分檢測出現污染后，可能所用耗材、稱樣、核酸提取、試劑、反應體系等被污染；要從操作環境、樣品粉碎、稱樣、核酸提取、反應體系的制備、擴增、PCR產物鑒定等各個環節逐一排除。（1）操作環境凈度不夠。環境中存在氣溶膠、陽性核酸、陽性PCR產物等。采取措施：桌面用酒精擦試。房間開窗通風一周左右。（2）樣品粉碎時污染。用玉米碴、要粉碎的樣品多過幾次粉碎機，每次粉碎完都用毛刷、氣槍清理干凈。（3）用酒精擦凈稱樣用的天平，稱樣時帶一次性手套，并及時更換。（4）操作儀器和實驗用具消毒不嚴。耗材、加樣槍、容器、雙蒸水等嚴格消毒。離心機的轉子、離心孔、內腔用酒精消毒。（5）核酸提取時試劑污染。更換試劑。（6）反應體系污染。更換所有的試劑及引物。（7）擴增時PCR儀污染。用酒精擦拭PCR儀的小孔及蓋子。（8）PCR產物鑒定時污染。更換電泳緩沖液、上樣緩沖液及Mark等。

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1007-1733(2014)11-0040-01

2014–08–08）