口腔癌淋巴管生成及淋巴轉移的研究進展

王 通，沈 軍

(1天津醫科大學，天津300070;2天津市口腔醫院)

口腔癌為頭頸部常見的惡性腫瘤，其發病率約占全身惡性腫瘤的3%，其中口腔頜面部的鱗狀細胞癌占80%以上。雖然以手術切除為主的序列治療對口腔癌原發灶的控制率有了顯著提高，但是其5年生存率仍為50%～55%［1］。淋巴道轉移是口腔癌各階段進展的主要轉移方式，臨床表現為淋巴管癌栓及淋巴結受累。有研究表明，50%的口腔癌患者在首診時已經發生淋巴結轉移［2］。據統計，確診發生區域淋巴結轉移的口腔癌患者5年生存率下降一半左右，所以淋巴結轉移被認為是影響患者預后的首要因素。目前，癌細胞轉移與腫瘤淋巴管生成的研究仍在探討中。首先，自上世紀70年代Folkman提出腫瘤組織內血管生成學說以來，大部分研究都集中于血管形成與腫瘤增殖、轉移的關系，忽略了淋巴管路在癌細胞遷徙、轉移中所起的作用。其次，尚未發現特異的淋巴管內皮標志物，在一定程度上阻礙了口腔癌淋巴管生成的研究。目前，隨著血管內皮生長因子(VEGF)-C、VEGF-D、透明質酸酶受體-1(LYVE-1)等淋巴管內皮標記物的發現，腫瘤淋巴管生成的研究迅速起步，研究口腔癌淋巴管生成的機制，抑制其生成的靶點，將有望開辟惡性腫瘤治療的新途徑。

1 淋巴系統的解剖學基礎和功能

淋巴系統由淋巴管、淋巴組織和淋巴器官組成。淋巴管主要包括毛細淋巴管、淋巴管、淋巴干和淋巴導管。毛細淋巴管僅由內皮和極薄的結締組織構成，無周細胞。電鏡下，毛細淋巴管外周缺少平滑肌，管周無基膜，管壁菲薄，管腔大，管壁由單層內皮細胞組成，內皮細胞間連接疏松，有較寬的間隙，甚至呈開放狀態，故通透性大，大分子物質易進入。生理狀態下，淋巴系統的主要功能是將組織間液和大分子物質轉運入血液循環，保持組織內正常的體液容量，從而維持內環境的穩定;在機體免疫過程中可將抗原提呈細胞及淋巴細胞逐步運送至外周毛細淋巴管或區域淋巴結，完成免疫應答;另外，還可完成脂肪的消化、吸收功能。

2 腫瘤淋巴管研究的技術進展

2.1 淋巴管注射法 分為直接和間接注射法。直接注射法即將有色溶劑注射于淋巴管或淋巴結內，使其顯色后進行觀察。由于水銀有一定毒性，僅限于對尸體淋巴管進行注射，現逐步被油性注射劑和水性注射劑所取代。間接注射法是將注射用有色溶劑(如1%亞甲藍、2%～4%的天藍等)注入組織間隙內，借助注射劑的擴散作用，使其通過毛細淋巴管內皮細胞間隙，進入管腔，進而使毛細淋巴管及下一級淋巴管顯色。

2.2 動脈內墨汁—硝酸銀注射法［3］即將墨汁—硝酸銀注入動脈內來研究淋巴管的方法，適用于活體動物或新鮮尸體標本。首先暴露被檢器官的動脈，注入33 g/L硫酸鈉溶液，將動脈內及相應器官內的剩余血液沖出，然后注入硝酸銀水溶液及墨汁—硝酸銀溶劑至該器官呈現黑色，然后用甲醛固定被檢器官，切取部分組織經沖洗、乙醇脫水、石蠟包埋、切片并封片等步驟，將切片置于陽光下曬2～3 d，利用紫外線將硝酸銀還原為黑色的銀顆粒，沉積于內皮細胞上，于顯微鏡下便可觀察淋巴管及其內皮細胞的結構。

2.3 淋巴管造影法 淋巴管造影法是將X線阻射的物質注入淋巴管，通過X線透視觀察顯影的淋巴管或淋巴結。常用的造影劑有稀碘油、碘酞葡胺等，臨床常用Patent藍行皮下注射，直接將碘油制劑注入淋巴管行造影術，進行腫瘤淋巴道轉移的相應研究。

2.4 酶組織化學染色法 根據某些酶等化學成分的含量在淋巴管和血管中的差異來區分淋巴管和血管，適用于新鮮標本。較特異的方法是5’-核苷酸酶—堿性磷酸酶雙重染色法，淋巴管及毛細淋巴管呈棕色或褐色，而血管及毛細血管呈現藍色。毛細淋巴管對5’-核苷酸酶呈陽性反應，而毛細血管對堿性磷酸酶呈陽性反應，根據淋巴管內皮細胞與毛細血管內皮細胞酶譜活性差異及底物與之反應后不同的產物，鑒別淋巴管及血管，進而行淋巴管相應的研究。

2.5 免疫組織化學法 應用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性及定量的研究。因毛細淋巴管相對于毛細血管內皮細胞少、且缺乏完整的基底膜，用Ⅳ型膠原及B27雙重免疫組織化學染色使毛細淋巴管呈紅色，而毛細血管呈深藍色。但腫瘤血管基底膜在某些特定條件下有時也不連續或缺如，在行免疫組化染色時會出現假陽性結果，故該方法可靠性尚不穩定。

3 淋巴管內皮標記物

近年來，一些淋巴管內皮細胞標記物被發現，有關淋巴管生成的研究有了極大突破，這對于鑒別毛細淋巴管和毛細血管內皮，研究淋巴管內皮細胞來源、特性及淋巴管生成的調控和靶向治療都有重要意義。

3.1 血管內皮生長因子受體3(VEGFR3)VEGF是一組特異性作用于血管內皮細胞的多肽，VEGF家族包括 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 及胎盤生長因子(PLGF)等，有促進血管內皮細胞增殖、遷移及血管生成等作用。該家族的受體為酪氨酸激酶受體，主要包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3以及2個無活性受體。VEGF-C是VEGF家族中重要的組成部分，可與VEGFR2結合促進血管生成;又可與VEGFR3結合，促進淋巴管內皮細胞的增殖與遷移，調控淋巴管的發芽、增生，參與淋巴管的生成過程，并對胚胎發育和腫瘤的生長轉移起重要調節作用。

VEGFR3是第一個被發現的淋巴管內皮標記物，作為特異性表達于淋巴管內皮的分子之一，可以簡單而準確地識別淋巴管，其表達狀況與腫瘤的淋巴道轉移也有密切聯系［4］。但是對VEGFR3的深入研究發現，其不僅表達于淋巴管內皮細胞，在某些生理和病理狀態下也表達于人類正常的乳腺組織、鼻黏膜組織、有孔毛細血管的內皮細胞、慢性炎癥反應和腫瘤相關的血管內皮細胞［5］。

3.2 LYVE-1 LYVE-1是含有332個氨基酸殘基的膜蛋白，與CD44同源，均勻分布于淋巴管內皮細胞的基底面和胞腔面，參與淋巴管內皮對透明質酸的結合和吸收;還參與腫瘤細胞及白細胞的歸巢。LYVE-1是第一個在淋巴管內皮上發現的透明質酸受體，也是一種比較可靠、特異性較好的淋巴管內皮細胞標記物。最近研究發現，該受體也表達于肝血竇內皮細胞和腎、腎上腺、胰、甲狀腺上皮細胞，且腫瘤內約有10%的LYVE-1陽性脈管是血管。

3.3 腎小球足突細胞膜蛋白(Podoplanin)Podoplanin最初發現于腎小球足細胞表面，是一種黏液樣跨膜糖蛋白［6］。Podoplanin特異性表達于淋巴管內皮，而在血管內皮中無表達，可作為淋巴管內皮標志物，并逐步用于腫瘤淋巴管生成及其淋巴轉移的研究中，其在多種腫瘤中的淋巴管內皮細胞表達上調。Parr等［7］認為在結腸癌及周邊組織中淋巴管形成增加，且Podoplanin表達增高與腫瘤的淋巴結轉移高度相關。

3.4 同源異型核轉錄因子1(Prox-1)Prox-1在內皮細胞中僅特異性地表達于胚胎淋巴管、成人正常組織淋巴管及腫瘤內淋巴管，在非內皮細胞中可以存在于晶狀體、心臟、神經系統等組織器官中［8］。Wigle等［9］對小鼠模型淋巴管研究發現，Prox-1缺失會影響淋巴管的發育，甚至導致機體死亡，但不會影響血管生成。Chang等在研究非小細胞肺癌組織中Prox-1的表達時發現，Prox-1表達水平越高，腫瘤的TNM分級越高，且淋巴結轉移率也相應增高，認為Prox-1可以作為預測非小細胞肺癌淋巴管轉移的重要蛋白。

3.5 多功能非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白(NRPs)NRPs包括NRP-1和NRP-2。近年研究發現，NRPs可能與淋巴管生成、腫瘤淋巴管新生及淋巴道轉移有密切關系［10］。Xu等［11］通過小鼠動物實驗模型研究發現，NRPs能調節VEGFR3在淋巴管內皮上的表達水平，進而調控淋巴管的發芽生長，促進成熟小鼠體內淋巴管樹的發展和增殖。在腫瘤淋巴管新生及淋巴道轉移的研究中也提出了同樣的觀點。Ochiumi等［12］對進展期結腸癌的研究結果顯示，NRP-1高水平表達組淋巴結轉移率顯著高于低水平組，由此推斷，NRP-1表達水平與結腸癌淋巴結轉移率相關。此外，Dallas等［13］也提出NRP-2的表達水平與胰腺癌細胞的生長、局部浸潤及淋巴結轉移相關。

3.6 D2-40 D2-40分子是在生殖細胞腫瘤和胚胎睪丸的精母細胞表面新發現的一種唾液酸黏蛋白，是最新發現的特異性標記淋巴管的鼠來源IgG1單克隆抗體。近來研究發現，D2-40抗體能通過與唾液酸蛋白特異性結合檢測腫瘤淋巴管內皮上固定的抗原決定簇，其敏感度和特異性均都高于其他淋巴管內皮的分子標志物［14］。D2-40可用來標識多種腫瘤的新生微淋巴管內皮上的抗原決定簇，該抗原決定簇在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和血管內皮上沒有表達［15］。甄樂鋒等［16］用 D2-40進行免疫組化染色標記組織淋巴管時發現，其僅在被覆單層內皮細胞的小淋巴管如終末淋巴管顯色，為一種特異性較強的淋巴管標記物，對于淋巴管生成的研究具有較好的實用意義。

4 淋巴管生成與腫瘤轉移的關系

淋巴轉移是腫瘤轉移的主要途徑之一，也是決定患者治療方案及預后的重要因素;同時淋巴管的生成對腫瘤的轉移起重要作用。早期由于缺乏淋巴管特異性標記物等原因，對于腫瘤淋巴管生成的研究相對滯后，但對于腫瘤淋巴結轉移時淋巴管侵襲的理論，還是被大部分學者認可。腫瘤細胞到達淋巴結后，在邊緣竇處增殖，由于毛細淋巴管管壁由單層內皮細胞組合，細胞間缺乏緊密連接，且管腔基底膜不完整，有利于腫瘤細胞穿過管壁進入管腔，在腫瘤原發部位或轉移器官的淋巴管管腔內聚集成瘤栓，然后進入下一級淋巴管，最終以阿米巴樣運動的形式進入淋巴結實質［17］。

2009年，Mohammed等［18］在乳腺癌的研究中證實了癌巢內部無淋巴管存在，僅在癌灶邊緣及癌周組織中發現毛細淋巴管。腫瘤內存在新生淋巴管，但其管壁菲薄，細胞間連接疏松，管腔常呈塌陷或閉塞狀態，為非功能性淋巴管［19］;而瘤周淋巴管常彌漫分布于腫瘤周圍，管腔呈擴張狀態，更有利于腫瘤細胞的侵入。目前，VEGFR3介導的信號通路是公認的淋巴管生成的主要調控機制;另外，Prox-1作為淋巴管生成的基本調控因子也起至關重要的作用。腫瘤細胞可以通過分泌VEGF-C、VEGF-D、Prox-1等調控因子來誘導淋巴管生成，并促進腫瘤細胞的淋巴轉移。

淋巴管密度及單位面積中毛細淋巴管及淋巴管的數目，是客觀評估腫瘤新生淋巴管的重要指標，并可以預測淋巴結轉移的風險及預后。相關研究發現，瘤周淋巴管密度顯著高于瘤內淋巴管密度，且瘤周淋巴管密度與腫瘤淋巴結轉移高度相關。

5 口腔癌淋巴管生成及淋巴轉移

研究發現，口腔癌的癌組織中存在淋巴管內皮細胞增殖及淋巴管增生。危由春等［20］認為VEGF-C可誘導口腔癌淋巴管內皮產生，促進其增殖和遷移，導致淋巴管在癌巢周圍增生，且這種增生的淋巴管與正常組織淋巴管在形態結構及組織學上有較大差異。李慧文等［21］選取62例舌鱗癌組織，以VEGFR3標記其淋巴管，發現陽性淋巴管主要分布在癌組織周圍，癌間質未見明顯成形淋巴管，認為其原因是癌巢腫瘤細胞的膨脹性生長壓迫間質淋巴管使其閉鎖。

口腔頜面部有豐富的淋巴管通路及吻合支，為癌細胞的淋巴轉移提供了便利途徑;而且舌、頰等組織由于運動頻繁，也為癌細胞的早期擴散提供了有利條件。口腔癌的淋巴轉移往往通過淋巴管轉移到區域淋巴結，淋巴結轉移是原發灶復發及生存率降低的重要原因。目前通常通過切除已腫大的淋巴結及臨床上懷疑存在轉移的區域淋巴結行病理檢查，確定是否存在淋巴結轉移;然而，已有文獻報道口腔鱗癌存在頸淋巴結隱匿性轉移，僅依靠臨床TNM分期評估患者頸淋巴結狀態及預后是遠遠不夠的。

鑒于淋巴管生成在口腔癌淋巴轉移中的重要作用，抗淋巴管生成治療有望成為新的口腔癌治療方法，但這種治療是否對正常組織淋巴管及血管的正常生理功能有不良影響，還有待進一步研究。早期采取分子生物學等方法檢測VEGFR3、LYVE-1等淋巴管內皮標記物，可為口腔癌的診斷及預后評估提供重要的參考信息。

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