FISH技術對自然流產患者胎盤絨毛染色體數目的檢測結果分析

厲吉霞，王延桂，夏西燕，李曙晨，吳海霞，莊學偉

(1煙臺市煙臺山醫院，山東煙臺264001;2濟南護理職業學院; 3山東大學齊魯醫院)

自然流產為常見疾病，發病原因較多，其中染色體異常尤其是數目異常引起者占50%以上［1］。熒光原位雜交(FISH)技術是一種具有高度靈敏性和特異性的染色體和基因分析技術，可選擇的標本范圍廣泛(包括胎盤絨毛、羊水、臍血、孕婦外周血及宮頸沖洗液)，目前廣泛用于染色體異常的產前診斷，并逐步發展到植入前遺傳學診斷。2011年8月～2014年1月，我們應用FISH技術對45例不明原因流產患者進行了13/16/18/21/22/X/Y染色體數目異常檢測，旨在為分析自然流產原因提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期收治的不明原因自然流產者42例，年齡23～37歲(平均28歲)，妊娠時間6～20+6周。其中首次流產29例、復發性流產13例(2次流產9例、3次以上流產4例)。42例均留取胎盤絨毛組織待檢。

1.2 染色體數目檢測 采用13/16/18/21/22/X/Y染色體數目檢測試劑盒 GLP13/GLP21、GLP16/ GLP22、CSP18/CSPX/CSPY。具體步驟:①玻片制備:檢測標本以生理鹽水洗凈后剪碎，置于5 mL濃度為0.075 mmol/L的KCl低滲溶液中，37℃水浴20 min;緩慢加入固定液2 mL，吹打混勻后1 500 r/ min離心10 min，去上清后再重復2次，離心后去上清，于沉淀物中加1～2 mL冰醋酸，消化1 min后制備成細胞懸液滴片，于56℃老化玻片2 h以上。②玻片預處理及變性雜交:室溫下，將玻片于2×SSC溶液中漂洗5 min，37℃下于0.08 mg/mL胃蛋白酶中消化5 min，再于2×SSC溶液中漂洗5 min，依次在70%、85%、100%的梯度乙醇中脫水各3 min，干燥;探針在雜交儀共變性(75℃，5 min)，雜交(42℃，16 h)。③玻片洗滌:2×SSC溶液中洗滌10 min，轉入0.1%的NP-40洗滌5 min，用70%乙醇洗滌3 min。④復染:用聯咪二苯吲哚(DAPI)復染。⑤結果判讀:每組探針計數100個細胞，正常細胞＞90%提示指標正常、異常細胞＞60%提示指標異常，介于兩者之間者加大計數再判定。

1.3 統計學方法 采用簡明統計(CS14.0)軟件進行數據處理。率的比較行χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

42例中18例(42.85%)檢測出染色體數目異常，其中三體型異常8例(19.04%)，包括13三體1例(2.38%)、16三體5例(11.90%)、22三體2例(4.76%)，未見18三體及21三體;三倍體異常3例(7.14%);四倍體異常2例(4.76%);單倍體異常5例(11.91%)，其中X單體4例、21單體1例。首次流產和復發性流產者中分別有11例(37.93%)、7例(53.85%)檢測出染色體數目異常，兩者比較，P＜0.05(χ2=5.153)。

3 討論

FISH技術為新興的分子細胞遺傳學技術，其原理是利用熒光標記的DNA探針與被檢測樣本中DNA堿基對的互補性，在探針與樣本DNA雜交后，通過熒光顯微鏡檢測熒光信號發現細胞、組織樣本中的染色體或基因異常。FISH技術的優點是可在獲得羊水24 h內(無需培養)得到關于13、18、21、X、Y的染色體數目信息。此外，該技術對于樣本的要求比較低，對羊水量少、羊水活細胞數目少、孕周偏大、細胞培養失敗、核型結果難以判讀等各種原因導致核型分析失敗者均可進行針對性彌補檢測。因此，FISH技術拓展了細胞遺傳學的檢測范圍、提高了細胞遺傳學識別異常的能力，可彌補核型檢測失敗的缺陷。

懷孕早期自然流產者中有50%～60%存在染色體異常［1～5］，主要是染色體數目異常(染色體結構異常者＜5%)，其中16三體是最為常見的染色體數目異常類型［6，9］，13、14、15、18、21、22三體較少，1、5、9三體僅有個例報道［6～8］。本研究顯示，42例中染色體數目異常者占42.85%，與文獻［2，5］報道的43.33%～44.40%基本相符;國外也有報道在53%～54%，考慮與樣本取材及樣本量有關。在人類常染色體中，除13號染色體外，其他染色體均存在三體型病例;染色體多態性研究表明，約75%的常染色體三體源于女性第一次減數分裂不分離的染色體，而三體型異常最多見的是16三體，其次是22、21、15、14三體。本研究顯示，染色體數目異常以三體型最多(占19.04%)，其中16三體比例最高，與文獻報道相符。說明染色體非整倍體畸變是導致胚胎流產的主要原因之一。三倍體的每號染色體均為3條，約80%為雙精子受精，少數是二倍體卵子或二倍體精子受精，其胚胎有69XXX、69XXY、69XYY三種核型，大多數生長緩慢，一般在孕15周前流產，本組發生率為7.14%。單倍體異常指細胞染色體總數為45，缺少的染色體主要見于性染色體，目前所知的惟一常染色體單體是21單體;45，X核型是自然流產中較常見的染色體異常(10%～20%)，本組占8.89%;四倍體一般少見，由合子早期有絲分裂失敗所致，胚胎常在早期流產，本組發生率為4.76%，比例最低。此與文獻［5］報道相符。

有關流產次數與胚胎染色體異常發生率關系的研究［9～11］結論不一。本研究顯示，復發性流產者染色體數目異常率顯著高于首次流產者。提示自然流產的次數與胚胎染色體數目異常可能有關。染色體結構異常是染色體斷裂和重排的結果，一般比例＜5%［1，3］。本研究所使用的探針不具有基因定位功能，但如選擇合適的探針可實現對染色體結構異常的診斷。因此。FISH技術雖是常規核型分析技術的必要補充，但不可能完全代替常規染色體核型分析，其還有待于進一步發展和完善。

綜上所述，自然流產者胎盤絨毛染色體數目異常率較高(尤以復發性流產者為著)，FISH技術檢測染色體數目有助于某些疾病的產前診斷。

［1］樂杰.婦產科學［M］.7版.北京:人民衛生出版社，2004:83.

［2］Jobanputra V，Esteves C，Sobrino A，et al.Using FISH to increase the yield and accuracy of karyotypes from spontaneous abortion specimens［J］.Prenat Diagn，2011，31(8):755-759.

［3］Lebedev IN，Ostroverkhova NV，Nikitina TV，et al.Features of chromosomal abnormalities in spontaneous abortion cell culture failures detected by interphase FISH analysis［J］.Eur JHum Genet，2004，12(7):513-520.

［4］Jobanputra V，Sobrino A，Kinney A，et al.Multiplex interphase FISH as a screen for common aneuploidies in spontaneous abortions［J］.Hum Reprod，2002，17(5):1166-1170.

［5］朱瑞芳，朱海燕，王皖駿，等.用熒光原位雜交技術分析自然流產組織中的染色體異常［J］.中華醫學遺傳學雜志，2012，29 (5):606-607.

［6］Be CR，Velasquez PM，Youlton RR.A cytogenetic study in 609 abortions［J］.Rev Med Chile，1997，125(3):317-322.

［7］Hassold T，Chen N，Funkhouser J，et al.A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions［J］.Ann Hum Genet，1980，44(Pt 2):151-178.

［8］Hanna JS，Shires P，Matile G.Trisomy1 in a clinically recognized pregnancy［J］.Am JMed Genet，1997，68(1):98.

［9］秦爽，肖青，鐘卓慧，等.熒光原位雜交技術檢測130例自然流產絨毛染色體結構的觀察與分析［J］.中華臨床醫師雜志(電子版)，2012，6(13):173-175.

［10］Rubio C，Simon C，Vidal F，etal.Chromosomal abnormalitiesand embryo development in recurrent miscarriage couples［J］.Hum Reprod，2003，18(1):182-188.

［11］Bianco K，Caughey AB，Shaffer BL，et al.History ofmiscarriage and increased incidence of fetal aneuploidy in subsequent pregnancy［J］.Obstet Gynecol，2006，107(5):1098-1102.