化療聯合樹突狀細胞回輸治療急性髓細胞白血病的療效觀察

徐 珺，袁國林，呂婷婷，田小龍，黃 瑩

(襄陽市中心醫院，湖北襄陽441021)

目前，急性白血病(AL)的治療手段主要是化療和干細胞移植。隨著醫學科技迅速發展，雖然一定程度上提高了急性髓細胞白血病(AML)的緩解率，但由于微小殘留白血病(MRD)的存在，復發仍是影響患者無病生存的重要因素，因此，最大限度地殺滅殘留腫瘤細胞是防止復發的關鍵。樹突狀細胞(DC)免疫治療是其主要的方法，也是目前細胞免疫治療的熱點。為探討化療聯合DC回輸治療AML的臨床療效，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年11月～2011年11月我院收治的AML患者21例，男11例、女10例，年齡21～70歲、中位年齡42歲，均符合張之南主編的《血液病學》中的 AML診斷標準［1］，M1 3例、M2 15例、M4 2例、M5 1例;均為化療后獲得細胞形態學完全緩解者。將患者隨機分為對照組10例，觀察組11例，兩組臨床資料有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DC制備及鑒定 觀察組簽署知情同意書后，用血細胞分離機采集其外周血單個核細胞，經淋巴細胞分離液離心獲得單個核細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中，培養2 h后洗去非貼壁細胞，將獲得單個核細胞中的貼壁細胞調整密度為5×106/mL進行培養。加入粒單細胞集落刺激因子(GM-CSF)1 000 U/mL、白介素 4(IL-4)500 U/mL、TNF-α 500 U/mL，培養單個核細胞分化為成熟DC。培養10 d后，收集懸浮的DC，在光鏡下觀察其形態結構，采用流式細胞術檢測DC表型。取培養的DC行免疫治療。

1.2.2 治療方法 兩組均行常規化療，方案如下:①MA方案:米托蒽醌10 mg靜滴，第1～3天;阿糖胞苷(AraC)0.1 g靜滴，12 h一次，第1～7天。②DA方案:柔紅霉素40 mg靜滴，第1～3天;AraC 0.1 g靜滴，12 h一次，第1 ～7 天;或 AraC 1.0 g靜滴，12 h一次，第1～3天。③AA方案:阿克拉霉素40 mg靜滴，第1～3天;AraC 0.1 g靜滴，12 h一次，第1～7天。④HA方案:高山尖杉酯堿4 mg靜滴，第1～3天;AraC 0.1 g靜滴，12 h一次，第1～7天。⑤CAG方案:阿霉素10 mg靜滴，第1～4天;AraC 0.15 mg靜滴，第1～14天。在常規化療基礎上，觀察組在患者雙頸部、腋下、腹股溝淋巴結區6部位行DC 106個/次皮下注射，2 d一次，6次為一療程，間歇2個月后治療第2個療程。

1.2.3 評價方法 依照張之南主編的《血液病學》中的療效評價標準，療效指標包括持續緩解率、復發率、中位生存時間。采用流式細胞儀檢測MRD細胞。

1.2.4 統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件，計量數據以±s表示，組間比較用t檢驗;計數資料用百分比表示，組間比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DC形態 在倒置顯微鏡下，成熟DC貼壁生長，細胞體積增大，大小不等。培養初可見多數圓形貼壁細胞，加入GM-CSF、IL-4 48 h后，懸浮細胞增多;72 h后大量細胞集落，細胞數增多，體積增大，細胞表面伸出毛刺樣突起;第5天多數細胞重新貼壁;第6天懸浮細胞增多，細胞聚集，表面突起增多;加入TNF-α后第7～8天集落分散，細胞懸浮生長，分布較均勻，大小為成熟單核細胞的1.0～1.5倍，可見典型的樹枝樣突起。電鏡下見細胞表面大量褶皺和粗細不等的樹枝樣突起;透射電鏡下見細胞形態不規則，表面伸出多級突起，細胞核清晰，細胞質內線粒體豐富，粗面內質網發達，可見溶酶體。

2.2 DC表型鑒定 體外培養10 d后的DC表型為CD83+(67±4)%，HLA-DR+(75±6)%，CD11c(62±8)%，提示DC成熟。

2.3 兩組療效比較 觀察組11例共接受DC治療44次，其中1例8次、2例6次、8例3次。DC治療后，持續緩解7例(64%)、復發4例(36%)，中位生存時間18個月。對照組10例治療6個療程后，持續緩解2例(20%)、復發8例(80%)，中位生存時間9個月。兩組持續緩解率、復發率及中位生存時間比較P均＜0.05。

2.4 兩組MRD細胞比較 觀察組治療后MRD細胞＜10-4個，對照組 MRD細胞10-2～10-4個，兩組比較 P ＜0.05。

2.5 不良反應 觀察組皮下注射DC順利，無反應，除3例輕微發熱(體溫37.8℃，自行降至正常)、2例全身疼痛(對癥處理后2 d緩解)外，未見其他不良反應。

3 討論

自20世紀60年代以來，隨著抗腫瘤新藥的應用，明顯改善了AL患者的近、遠期療效。但經化療后到臨床及血液學完全緩解，體內仍有106～108個MRD細胞，其成為白血病緩解期短、復發快的主要原因。研究發現［2］，在完全緩解的AL患者中，80%因MRD復發影響長期生存。因此，化療后MRD細胞是復發的主要根源，治療MRD成為降低復發亟待解決的難題。近年研究發現，細胞免疫治療在消除MRD細胞、降低復發率、提高患者總生存率方面具有重要地位。

研究發現，惡性腫瘤患者免疫力低下，缺乏強有力的抗腫瘤免疫應答，腫瘤抗原不能有效地提呈給淋巴細胞，是造成腫瘤細胞逃逸、增生活躍的原因［3］。DC是目前公認的體內功能最強大的專職性抗原提呈細胞，其能激活靜息型T細胞，主要參與細胞免疫及T細胞依賴性體液免疫反應，在抗白血病細胞免疫應答中起重要作用。來源于外周血單核細胞的DC稱為mDC，主要表達CD33、HLA-DR和CD11c;來源于漿細胞樣的DC稱為pDC，主要表達HLA-DR和 CD123。研究表明，mDC通過合成和分泌IL-12促使靜息Th細胞向Th1細胞分化，引發Th1反應，啟動Th1細胞分泌IL-12，進一步促進Th1細胞分泌干擾素γ，以增強細胞毒T細胞的功能，在腫瘤免疫效應中發揮關鍵作用［4］。研究發現，完全緩解的AML患者存在DC功能低下。國內外學者對AML患者骨髓中DC亞群的定量分析顯示，其mDC功能和數量降低［5～8］。AL的發生、發展與機體免疫功能失調密切相關，免疫系統無法識別和清除惡變和突變的細胞，致使腫瘤細胞逃逸機體免疫系統的監視和清除;另外，化療無法及時清除惡性腫瘤綜合治療后的MRD細胞，最終需動員機體的免疫功能方可達到其作用［9］。我們前期的研究發現［10］，完全緩解 AML 患者行 G-CSF、GM-CSF 治療后，其DC活性升高，促淋巴細胞的增殖能力增強，且偏向mDC生長。本研究顯示，觀察組用G-CSF、GM-CS治療后，DC高表達 CD83、HLA-DR和CD11c，主要為mDC細胞;與對照組比較，其持續緩解率高、中位生存時間長、復發率低。

研究表明，MRD能早期判斷患者體內的殘留白血病細胞，預測其復發率，早于臨床預測復發3～6個月［2］。本研究發現，觀察組行DC治療后的MRD細胞比率明顯低于化療后，且其MRD細胞＜10-4個的比率明顯高于對照組，說明DC治療可明顯清除MRD細胞。提示DC治療具有抗腫瘤細胞作用，可在一定程度上減少疾病的復發。本研究結果與國內外相關報道一致［11～13］。

綜上所述，DC治療能明顯清除完全緩解AML患者的殘留白血病細胞，預防復發，值得臨床推廣應用。

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