銅吸收與代謝的研究進展

宋明明，黃 凱，朱連勤

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

銅是人和動物機體內必需的微量元素，在機體代謝、生長發育和調節免疫功能方面發揮重要作用。其不僅通過構成機體內的含銅酶（如超氧化物歧化酶、金屬硫蛋白、銅藍蛋白、賴氨酰氧化酶等）參與機體代謝過程，而且參與機體造血、自由基防御等活動，對動物的生長繁殖、骨骼發育和免疫等生理機能發揮著重要的作用[1]。銅主要經過消化道吸收，細胞將銅攝取后，將其轉運到亞細胞器如線粒體、微粒體、溶酶體中貯存，從而調控體內許多蛋白質和酶[2]。因此，銅作為動物機體內必需的微量元素逐漸得到深入廣泛的研究。

1 銅在動物體內的分布及貯存

成年動物體內含銅量為0.00015%～0.00025%，新生動物體內銅的含量與其母體內的含銅量密切相關，除羔羊外，新生動物因其肝銅較高而含銅較高，新生犢牛機體含銅較其他動物都高，平均約含13～14mg，新生仔豬含銅2.5～4mg，剛出殼的仔雞僅含銅60～80μg。對于哺乳動物而言，銅在整個胃腸道都有吸收，但絕大多數通過小腸吸收。更確切地說，銅主要在十二指腸被吸收，之后經紋狀緣進入腸細胞。腸道銅源以食物銅為主，此外還包括內源性器官或細胞分泌（唾液、胃液和胰液等）的銅，這些銅可以被腸道重吸收。植物性飼料中的銅主要以穩定的可溶性復合物（如氨基酸形式的復合物）形式吸收，而不是以離子形式吸收，動物不能有效利用硫化銅與卟啉銅化合物中的銅。銅的吸收過程分兩步，即銅先從腸腔進入黏膜細胞，然后從黏膜細胞進入血液，其中，從腸腔到黏膜是自由擴散過程，銅被腸道黏膜吸收后部分迅速進入血液循環，并很快沉積在肝臟，另有一部分則與金屬硫蛋白結合，存儲于腸黏膜上皮細胞內，吸收入血的銅主要與血漿銅藍蛋白結合，少量與白蛋白和氨基酸結合，其中前者結合較牢固，后兩者與銅結合得較松散。徐晨晨等報道，動物體內的銅主要分布在肝、腦、心、腎臟及毛發等器官中，在脾、肺、腸中也有少量分布[3]。銅在血液中主要以紅細胞銅藍蛋白和血漿銅藍蛋白兩種形式存在，然后經由血液循環到達其他的器官并與其中的蛋白質結合。李宏等報道，肝臟是動物體內銅貯存和銅代謝的重要器官[4]。成年哺乳動物體內肝臟中50%的銅分別與腸黏膜內的超氧化物歧化酶和金屬硫蛋白（MT）相結合，二者均具有結合和轉運銅的作用。

2 銅在動物體內的吸收及轉運機制

目前關于銅離子的吸收和轉運機制，國內外都有相關研究報道，細胞表面銅的轉運和銅運輸到細胞內，銅轉運蛋白家族發揮了非常重要的作用。Petris等研究發現，除通過游離銅和血漿銅藍蛋白這兩種途徑攝取銅外，還存在其他銅的吸收方式[5]。細胞對銅的攝取主要是通過銅轉運蛋白和金屬硫蛋白來實現的，當然金屬反應轉錄因子也是不可或缺的[6]。銅離子通過胃壁和小腸刷狀緣表面被吸收入腸黏膜，與腸道細胞膜上的Ctr1蛋白結合，進入腸上皮細胞。然后通過MNK（ATP7A）介導，由腸上皮細胞轉運至門靜脈。銅進入血液后與血漿白蛋白結合，隨后被運輸到全身各組織細胞。胞外銅可被一種或多種高度銅親和力的跨膜蛋白（如Ctr1和DMT1）轉運至細胞內。銅一旦進入細胞質，就會與一組廣泛存在的蛋白質受體-胞內銅轉運蛋白或銅伴侶（如Coxl7、ATOX1等）結合。Coxl7是位于細胞質和線粒體中的分子伴侶，可將Cu+轉運至電子鏈末端的細胞色素C氧化酶（CCO），有助于線粒體的呼吸；Cu+可經過分子伴侶轉運至抗氧化物酶形成銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）；Cu+還可結合ATOX1，ATOX1轉運銅離子至銅依賴性ATPase，在肝臟ATPase參與膽汁中血漿銅藍蛋白合成和分泌，在腸上皮細胞ATPase將細胞內的銅轉運至血管經過血液循環到達全身[7]。在銅轉運過程中，二價金屬元素（銅、鎘、鋅）可促進腸壁組織合成MT，與腸黏膜細胞內的銅結合形成Cu-MT，滯緩銅向血液轉運。

3 銅轉運基因的功能

3.1 Ctr1

銅離子轉運蛋白家族主要包括銅離子轉運蛋白（Ctr）和銅離子轉運磷酸化ATP酶（Cu-ATPase）。目前發現的Ctr家族有Ctr1、Ctr2、Ctr3、Ctr4和Ctr5，其中以Ctr1的功能最為強大。Ctr1是位于動物細胞膜上高親合能力的銅轉運蛋白，最早發現于酵母轉鐵體系缺陷型菌株中，其結構和功能具有遺傳保守性。Ctr1在肝臟和腎臟中表達量最高，在腦和肌肉中表達量最低。Ctr1的主要作用是將銅離子從細胞外轉運到細胞內[8]。Aller等研究表明，細胞外的銅離子可以在富含蛋氨酸和組氨酸的N-末端停靠位點通過Ctr1寡聚體對稱的通道狀結構進入細胞內[9]。在銅轉運的過程中，Ctr1只轉運一價銅離子，因此需要在金屬還原酶和維生素C的輔助下先把二價銅離子還原成一價銅離子來實現Ctr1對Cu+的轉運。Ctr1的表達水平與細胞內銅離子濃度有密切關系，其表達量的多少直接對機體銅代謝產生影響，銅缺乏時可促進該蛋白的表達，過量則抑制其表達[10]。在卵巢腫瘤的細胞株培養中加入銅離子可迅速降低Ctr1表達[11]。李俐華報道，在銅離子（硫酸銅）和順鉑圓窗給藥后，大鼠耳蝸內Ctr1mRNA表達量降低[12]。也有研究認為，銅離子濃度對Ctr1 mRNA的表達無影響，因為Ctr1轉運銅的時候必須要先把Cu2+變成Cu+，才能進行轉運，Cu+進入細胞后，由銅伴侶蛋白Atox1（antioxidant protein1）將Cu2+轉給高爾基體（TGN）中的ATP7A（ATP-dependent copper transporter 7α）、ATP7B（ATP-dependentcopper transporter 7β）；在胞外銅濃度升高時ATP7A和ATP7B從高爾基體移向質膜邊上[13]。在小腸黏膜細胞上ATP7A將Cu2+由質膜排入血液。另外，研究發現，敲除Ctr1基因的小鼠在胚胎形成早期死亡率大大增高，妊娠期自然流產幾率增大，表明Ctr1在動物銅吸收中起關鍵作用。

3.2 Ctr2

Ctr2是酵母cDNA文庫中與Ctr1具有高度同源性（含有3個跨膜結構域）的蛋白，因其N端組氨酸和甲硫氨酸的含量比較低而不能結合大量的Cu+，所以被稱為低親合力轉運蛋白。Ctr2主要位于內涵體和溶酶體中，研究表明，細胞內銅代謝與Ctr2將銅轉運至溶酶體內有密切關系。Rees等研究表明，在金屬還原酶的存在下Ctr2可代替Ctr1進行銅的跨膜轉運，說明兩者對銅的轉運機制相同[14]。

3.3 ATP7A和ATP7B

研究證明，在銅伴侶蛋白的協同下Ctr1能與ATP7A、ATP7B蛋白共同維持細胞銅離子的平衡。ATP7A與ATP7B蛋白是兩種同源的Cu-ATP酶，兩者的同源性為54%～65%。ATP7A是糖基化的膜蛋白，而ATP7B是非糖基化的膜蛋白，兩種蛋白都包含8個跨膜結構域，胞質中的N-末端區域有6個富含半胱氨酸的銅離子結合位點（MXCXXC）。ATP7A蛋白分布于全身各組織器官中，其主要作用是將轉運出細胞的銅離子釋放至血液中，并重新分配轉運至其他組織內；而ATP7B主要存在肝臟中，少量在腦、腎臟和胎盤等組織表達，其主要作用是在高爾基體內接受銅伴侶蛋白傳遞銅，與銅藍蛋白前體結合成銅藍蛋白，或者可在高銅環境下重新定位，促進銅離子從膽道排出[15]。這兩種轉運體都是通過ATP酶水解將銅轉運至細胞膜內的小囊泡中，與細胞膜融合之后通過胞吐作用將銅轉出細胞外[16]。研究表明，鈣離子通道的開放可以刺激囊泡與胞膜融合，通過胞吐作用將銅排出細胞外[17]。研究證實，ATP7A和ATP7B的表達受銅離子濃度的調節。ATP7A和ATP7B在體內銅離子濃度處于平衡狀態時，均分布于細胞內的高爾基體；在銅離子濃度發生改變時也將重新分布。研究顯示，高銅使ATP7A從腸上皮細胞內的高爾基體轉移至基底膜外側的小囊泡，進而將銅離子轉運至血液中。而低銅使ATP7B從高爾基體中轉運至細胞的頂膜，將存在于肝臟中的部分銅離子分泌至膽道排出體外[18]。這與金黃色的色斑魚機制類似，給色斑魚飼喂高銅離子的膳食，上調了肝臟和小腸內ATP7BmRNA和ATP7AmRNA表達，說明二者主要通過膽汁分泌和腸道排泄排出多余的銅離子來自我保護[19]。ATP7A缺乏將減少胎盤和小腸黏膜上皮細胞銅的轉運，導致全身性銅缺乏。ATP7B的突變會引起銅藍蛋白合成下降導致膽汁銅排泄障礙，使過量的游離銅蓄積在肝臟中，加劇Wilson病。

3.4 金屬硫蛋白

金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于生物細胞內的低相對分子質量低、金屬含量高、無芳香氨基酸、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，通過調節細胞質內Cu+濃度（＜10-18mol·L-1）維持細胞代謝的平衡。MT含“Cys-X-Cys”三肽序列。與重金屬結合順序由強到弱依次為：Hg（Ⅱ）＞Ag（Ⅰ）＞Cu（Ⅰ）＞Cd（Ⅱ）＞Zn（Ⅱ）。MT參與微量元素的儲存及轉運代謝，頡頏電離輻射，清除羥基自由基，重金屬解毒，對機體發育過程的調節和免疫應激方面具有重要生理作用。MT參與銅、鎘、鋅等微量元素的代謝調節，可以和肝細胞中的銅結合形成Cu-MT來降低細胞內銅的毒性。過量的銅可誘導腸黏膜上皮細胞合成MT，部分銅與MT形成Cu-MT多聚體，隨上皮細胞的死亡和脫落排出體外。肝臟中的MT與銅濃度成正比，MT表達水平隨肝細胞中銅濃度升高而上調。

3.5 DMT1

DMT1又稱為天然抗性相關巨噬細胞蛋白2（NRAMP2）或二價陽離子轉運體（DCT1），能夠轉運Cu2+、Zn2+、Fe2+和Mn2+等二價金屬陽離子。在腸、肝、腎、腦等處有特征分布，主要存在于小腸絨毛的紋狀緣內，在其他組織細胞中定位于細胞膜或胞漿內內吞小體和溶酶體的膜上。DMT1攝取和轉運二價金屬離子時，優先攝取鐵，銅能與鐵競爭DMT1進行轉運。Arredondo等研究表明，高銅能降低DMT1mRNA的表達，導致DMT1轉運活性降低，由于銅加速DMT1的降解[20]。Marzullo等報道，銅缺乏時小鼠十二指腸的DMT1（+IRE）顯著提高[21]。Han等研究表明，CaCo-2細胞經過1μmol CuCl2處理1周后，提高DMT1的表達[22]。Tennant等報道，細胞內添加CuCl21μmol 24 h后反而降低DMT1的表達[23]。Knopfel等認為，DMT1是一種能量依賴型的銅轉運蛋白，并且這一形式是DMT1轉運銅的主要機制[24]。用DMT1反義寡核苷酸處理的腸黏膜Caco-2細胞，分別導致80%和48%的腸黏膜Caco-2細胞對鐵和銅吸收抑制。DMT1轉運一價銅離子的速度是二價銅離子的1 000%。Tennant發現對Caco-2和TC7細胞添加銅100μM后導致DMT1（+IRE）mRNA的表達量顯著下降，而對DMT1（-IRE）mRNA的表達量無影響[25]。

4 銅的排泄

成年動物對銅的表觀吸收率很低，銅的排泄是主動過程，飼料中銅的80%隨膽汁進入消化道，與氨基酸結合后經糞便排出體外。正常膽汁排泄銅的機制仍然不十分清楚，銅由體內轉運至膽道可能通過以下途徑：通過存在于肝細胞膜小管區的ATP依賴的銅轉運系統；通過包括溶酶體在內的囊泡轉運，銅和溶酶體酶一起釋放入膽道中；谷胱甘肽-銅，通過小管特異性有機陰離子轉運體轉運，其中第一條通路最為重要。少量經腎和腸壁排出，排出量約占5%和10%。糞和尿內的銅均是以氨基酸、多肽、煙酸及其他小分子化合物的形式排出。組織中的銅由銅藍蛋白介導轉運回肝臟代謝或從膽道排出，有極小部分的銅是由汗腺排出。

[1]Percival SS.Copper and immunity[J].American Journal of ClinicalNutrition，1998，67:1 064-1 068.

[2]Graden JA，Winge D R.Copper-mediated repression of the activation domain in the yeastMaclp transcription factor[J].Proc Natl Acad SciUSA，1997，94（11）:5 550-5 555.

[3]徐晨晨，王珂.微量元素銅在畜禽營養中的研究進展[J].畜牧與飼料科學，2013，34（10）:21-23.

[4]李宏，鄭中朝，郭大芬.日糧銅水平對兔組織器官中銅沉積量及銅代謝的影響[J].中國草食動物，2000，2（4）:11-13.

[5]Peris M J.The SLC31（Ctr）copper transporter family[J].Pflugers Archiv-European Journalof Physiology，2004，447（5）:752-755.

[6]Zhou H，Cadlgan KM，Thiele D J.A Copper-regulated transporter required for copperacquisition，pigmentation，and specific stages of development in drosophila melanogaster[J].Biochemical Journal，2003，278（48）:48 210-48 218.

[7]Kim H J，So H S，Lee JH，et al.Role of proinflammatory cytokines in cisplatin-induced vestibular hair cell damage[J].Head&neck，2008，30（11）:1 445-1 456.

[8]Lee J，Pena M M，Nose Y，et al.Biochemical characterization of the human copper transporter Ctr1[J].JBiolChem，2002，277（6）:4 380-4 387.

[9]De Feo C J，Aller SG，Siluvai G S，et al.Three-dimensional structure of the human copper transporter hCTRl[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（11）:4 237-4 242.

[10]付世新，張利，齊長學，等.銅對Ctr1基因mRNA表達的影響[J].黑龍江八一農墾大學學報，2009，21（6）:29-31.

[11]Holzer A k，Howell SB.The internalization and degradation ofhuman copper transporter 1 following cisplatin exposure[J].Cancer research，2006，66（22）:10 944.

[12]李俐華.Ctr1、ATP7A、ATP7B在大鼠順鉑耳毒性中的作用與硫酸銅的干預研究[D].長沙:中南大學，2012.

[13]Greenough M，Pase L，Voskoboinik I，etal.Signals regulating trafficking of Menkes（MNK;ATP7A）copper-translocating P-type ATPase in polarized MDCK cells[J].American Journal of Physiology:Cell Physiology，2004，287（5）:1 463-1 471.

[14]Rees E M，Thiele D J.Identification of a vacuole-associated metalloreductase and its role in Ctr2-mediated intracellular coppermobilization[J].JBiolChem，2007，282（30）:21 629-21 638.

[15]Kim B E，Nevitt T，Thiele D J.Mechanisms for copper acquisition，distribution and regulation[J].Nature Chemical Biology，2008，4（3）:176-185.

[16]Nyasae L，Bustos R，Braiterman L，etal.Dynamics ofendogenous ATP7A（Menkes protein）in intestinal epithelial cells:copper-dependent redistribution between two intracellularsites[J].American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology，2007，292（4）:1 181-1 194.

[17]SchliefM L，Craig AM，Gitlin JD.NMDA receptoractivationmediates copper homeostasis in hippocampal neurons[J].The Journal ofneuroscience，2005，25（1）:239-246，

[18]Monty JF，Llanos RM，Mercer JF，etal.Copper exposure induces trafficking of the menkes protein in intestinal epithelium of ATP7A transgenic mice[J].The Journal of Nutrition，2005，135（12）:2 762-2 766.

[19]MinghettiM，LeaverM J，George SG.Multiple Cu-ATPase genes are differentially expressed and transcriptionally regulated by Cu exposure in sea bream，Sparus aurata[J].Aquatic Toxicology，2010，97（1）:23-33.

[20]Arredondo M V，Cambiazo L，Tapia M.Copper overload affects copper and ironmetabolism in HepG2 cells[J].Am JPhysiolGastrointest Liver Physiol，2004，287（1）:27-32.

[21]Marzullo L，Tosco A，Capone R，etal.Identification ofdietary copper and iron-regulated genes in rat intestine[J].Gene，2004，338（2）:225-233.

[22]Han O，Wessling-Resnick M.Copper repletion enchances apical iron uptake and transepithelial iron transport by Caco-2 cells[J].Animal Journal Physiol Gastrointest Liver Physiol，2002，282（3）:527-533.

[23]Tennanta J，Stansfield M，Yamaji S，etal.Effects of copper on the expression ofmetal transporters in human intestinal Caco-2 cell model[J].Biometals，2003，16（1）:145-160.

[24]Knopfel M，Smith C，Solioz M.ATP-driven copper transport across the intestinal brush bordermembrane[J].Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2005，330（3）:645-652.

[25]Tennant J，Stansfield M，Yamaji S，et al.Effect of copper on the expression ofmetal transporters in human intestinal Caco-2 cells[J].FEBSLett，2002，527（1-3）:239-244.