分子生物學技術在臨床獸醫學上的研究與應用

肖延光 郝占忠 魏雅茹 王素紅 趙愛民 （山東省聊城市畜牧站 252000）

近年來,生物技術不斷向深度和廣度迅猛發展，其發展與動物疫病的診斷、預防和治療技術之間已并無明顯的界限，并且起了不可替代的作用;如轉基因動物既能用于抗病育種，也能用于生產疫苗和藥品;核酸疫苗具有預防和治療的雙重作用;單克隆抗體不但用于免疫診斷，也可用于被動免疫和導向藥物治療等。生物技術已經不是一項單一的技術，而是一個綜合的技術體系，尤其是在獸醫臨床上的應用、發展中，需要多種不同技術、學科和領域的相互滲透、相互配合。

1 核酸的分子雜交

基因探針技術是臨床應用最早的分子生物學技術，至今仍常盛不衰，它不僅用于微生物等基因鑒定方面，而且在印跡技術如(southern blot)方面以及新近成為熱門的基因芯片技術方面都有廣泛應用，不少探針已商品化。

2 PCR技術

PCR技術是一種體外模仿體內DNA復制(擴增)過程的技術。可以在短時間內大量復制出原來很少的DNA。其作為一種新的疾病檢測手段，具有靈敏、特異、簡便、快速等優點，可以從一根毛發、一滴血、一個細胞中擴增出足量的DNA供分析診斷;PCR技術已逐漸應用于遺傳性疾病、腫瘤及感染性疾病等的診斷。但該技術大多為定性分析，結果重復性差、可靠性低。因而，給臨床診斷帶來混亂。近年來常規PCR技術用于診斷、鑒定、科研、制備探針和進一步結合基因工程進行產品開發等，是一項極其有效、非常實用的技術，隨著分子生物技術的發展已衍生出許多新方法新技術，如:定量PCR技術、熒光PCR技術、巢式PCR、不對等PCR等。（1）定量PCR技術:定量PCR技術巧妙利用了PCR技術的DNA高級擴增、探針技術特異性和光譜技術的敏感性及定量分析的優點。克服了常規PCR定性檢測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性。（2）熒光PCR技術:對比常規PCR技術，其是一種良好的檢測HBV-DNA的方法。試驗特異性強、重復性好(批內、批間變異系數均<5%)，檢出陽性率和敏感性高。試驗條件標準化后，將有良好的臨床應用價值。

3 DNA(基因)酶切圖譜分析

（1）DNA(基因)酶切圖譜分析即用特定的限制性酶消化(水解切斷)DNA長鏈后，可以得到核酸的片段。由于不同的DNA堿基序列不同，用識別某一特定堿基序列的限制酶進行酶切時，所得到的DNA鏈片段的長短也不一樣(Makimura等，2002)。片段的長短可用凝膠電泳進行分離后，與一系列已知分子量(或堿基對，bp)的標準參照物(或稱標志物，marker)進行比較，大體計算出各片段的分子量或堿基數。這一方法已廣泛應用于臨床基因診斷。例如，當一個基因發生點突變后引起某一限制酶識別點改變，就可以用本法檢測出來。（2）臨床和科研中已沿用多年的DNA限制性片段長度多態性分析(RFLP )，就是本法具體應用的典型例子(Yu等，2002)。在畜群中，各個體基因的核苷酸序列會存在一定差異，稱為基因多態性。基因多態性位點普遍存在于動物的基因組中，某一致病基因與特定的多態性片段緊密連鎖，就可以用這一多態性片段作為一種“遺傳標記”來判斷畜群或幼畜是否攜帶有致病基因。目前認為基因多態性是個體的“身份證”;有的雖然不表現疾病，但也許會影響對藥物的反應和用藥效果，因而有人提出將來會出現按個體基因型選擇用藥的種類和劑量的所謂“個體化”用藥。

4 單鏈構象多態性(SSCP)分析

單鏈構象多態性是一種簡單、有效、快捷、廉價的檢測非常少量的基因組DNA或cDNA突變的技術。其原理及技術要點是:由于單一堿基的替代(改變)，引起DNA鏈構象改變(Calegari等，2002)。后者可導致DNA在非變性凝膠電泳中出現遷移率的改變。因此，首先用PCR技術擴增所檢驗的模板，然后進行變性、電泳、顯示，根據顯示的條帶與標準參照物對比，即可判斷所測DNA鏈是否有變異。

5 DNA序列測定

上述方法僅能大致了解某一核苷酸鏈片段是否存在變異，并不能確定哪一位點核苷酸發生變異和何種核苷酸取代了何種核苷酸，這就要求進行基因測序。關于DNA測序的方法，因其十分復雜，一般臨床實驗室無法進行。有必要時可委托有條件的公司或研究機構進行，本文從略。由近幾年世界范圍進行的人類基因組計劃(其主要步驟是基因測序)可知，當今基因測序是一項大規模工程，可以自動化進行。

6 DNA微陣列(DNA microarray)技術

DNA微陣列技術又稱蛋白質微陣列技術、生物芯片(biochip)技術，其是當前分子生物學領域最熱門的技術，國內外在競相開發，微陣列技術的大致步驟是:在一小片固相基質(如修飾過的玻璃或尼龍膜片)上，高密度地點上成千上萬個DNA片段，制成微陣列，即DNA或生物芯片。檢測時采用分子雜交手段，將熒光標記的標本與微陣列進行雜交，雜交完成并洗滌后，用激光共聚焦顯微掃描儀檢測熒光信號，通過微機處理分析，即可獲得檢測結果(Ja-cobs等，2003)。目前國內外已制出多種生物芯片商品，其實際應用亦已逐步展開。據文獻報道，微陣列技術應用范圍極廣如致病微生物的檢出、癌基因及抑癌基因、組織配型、基因表達的研究、基因功能分析、基因制圖、基因突變和多態性的檢測等，是一項非常有發展前景，適合臨床檢驗應用的先進技術。

7 熒光原位雜交染色體分析(FISH)

熒光原位雜交染色體分析是一種在染色體上進行基因定位的技術，其基本原理和步驟是:在已知某靶基因核苷酸序列的前提下，先合成與靶基因互補的經熒光標記的DNA探針，與常規方法制備的中期染色體進行原位雜交。在熒光顯微鏡下可以觀察到該靶基因所在的染色體(臂、區、帶、亞帶)(Home等，2002)。其是一項非常有用的技術，它不僅可用于基因在染色體上定位的研究，而且可直接用于實驗室診斷。例如，慢性髓系白血病患者的9號與22號染色體的長臂相互易位所形成的Ph染色體，形成了一個融合基因—bcrabl(并編碼表達一種叫P120BCR/ABL的蛋白質)，這是該病發病的重要因素。早先用染色體分析鑒定這種染色體變異，準確性差，陽性率也不高(Blasberg，2002)。改用bcrabl基因探針進行原位雜交很容易鑒定，并且不一定需要分裂中期的染色體，在核內處于間期的染色體也可檢出。目前在各類白血病中，已鑒定出好幾種類似的融合基因(Chatziioannou，2002)。為此，當前對白血病的實驗室診斷，已由過去的M(形態學)I(免疫學，即細胞表面分化抗原CD )C(細胞化學染色)改為MICM，后一M即指分子生物學。FISH在基因定位研究和診斷中的應用還很多。

8 單抗阻斷ELISA檢測副雞嗜血桿菌血清型特異性抗體

苗得園等在副雞嗜血桿菌A，C型特異性單克隆抗體的基礎上成功建立了能區分A，C血清型抗體的阻斷ELISA診斷方法(Maclean等，2003)。并應用此法對9種常見病原體陽性血清及多份免疫雞、人工感染雞、臨床可疑病雞血清和陰性血清進行了檢測，結果證明，本法具有較好的特異性和敏感性，而且操作簡便、快速，是一種適用于雞傳染性鼻炎的診斷、流行病學調查、檢疫和監測的良好方法。

一般來說，常規診斷技術具有應用簡便、快速、易于掌握、費用低等優點，是經歷了漫長的歷史發展過程得以鞏固和完善的，因此，具有比較強的生命力。而生物高科技診斷技術卻不具備這樣的優勢，不論是單克隆抗體還是核酸探針PCR等，其試劑的制備方法都比較復雜，需要昂貴的儀器設備和診斷試劑，對操作者的技術要求也較高，甚至對檢測結果的綜合評價也不很容易掌握(Her-schman，2003)。但是，現代生物技術作為一種高新技術，有著常規診斷方法不能比擬的優越性，分子生物學檢測技術具有極高的敏感性與特異性，能夠區別細菌和病毒的疫苗株和野毒株，甚至可區別病毒間單個核苷酸的差別，可以監測病原體的變異和漂移，預報疫病的大流行(杜立新，2003)，核酸探針和PCR技術還可檢測出整合到宿主體內的病原體，對于進行毒株鑒定、檢測隱性感染和免疫損害性疾病都具有重要意義。

因此，雖然在短時間內這些診斷新技術難以真正達到推廣應用，但對于重大疫情的及時預報和準確定性都是不可或缺的。

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