未成熟卵母細(xì)胞凍存

姜李樂，韋多，張翠蓮

（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究所，鄭州 450003）

在人類生育力保存方面，冷凍保存為輔助生殖技術(shù)不受空間、時(shí)間的限制提供了可能。胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍、卵巢組織冷凍是女性生育力保存的3項(xiàng)基本方案。三者各有優(yōu)缺點(diǎn)與局限性，其中卵母細(xì)胞冷凍因其特點(diǎn)和難點(diǎn)是現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)的重要組成之一，廣受關(guān)注［1］。介于成熟卵母細(xì)胞的來源有限、對(duì)低溫非常敏感的特點(diǎn)，提出冷凍紡錘體形成前的第1次減數(shù)分裂前期雙線期（GV期）或第1次減數(shù)分裂中期（MI期）的未成熟卵母細(xì)胞。冷凍保存未成熟卵母細(xì)胞有著廣闊的發(fā)展前景。本文從冷凍未成熟卵母細(xì)胞的優(yōu)勢、冷凍方法及影響因素等方面予以綜述。

一、冷凍未成熟卵母細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)

1.與冷凍胚胎相比：冷凍未成熟卵母細(xì)胞能夠解決胚胎冷凍臨床應(yīng)用局限性大的問題。目前胚胎冷凍保存已經(jīng)作為一項(xiàng)成熟有效的輔助生殖技術(shù)在臨床上廣泛應(yīng)用。但胚胎的產(chǎn)生常規(guī)需要行促性腺激素刺激卵巢，提取成熟卵母細(xì)胞以及在體外受精等過程。通常需要好幾周甚至幾個(gè)月的準(zhǔn)備時(shí)間，而收集未成熟卵母細(xì)胞10d之內(nèi)可以完成。冷凍胚胎并不適合不能延遲放化學(xué)治療的晚期惡性腫瘤患者、有激素使用禁忌癥的患者、幼女等［2］。同時(shí)，冷凍未成熟卵母細(xì)胞還緩解了胚胎冷凍存在的倫理、法律、道德、宗教多方面社會(huì)問題［3－4］。

2.與冷凍成熟卵母細(xì)胞相比：未成熟卵母細(xì)胞的來源更廣，可在月經(jīng)周期任何時(shí)間取卵，而成熟卵母細(xì)通常僅來源于體外受精（IVF）周期。收集未成熟卵母細(xì)胞減少了患者進(jìn)行超促排卵方案的經(jīng)濟(jì)與時(shí)間花費(fèi)，避免了卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生。另外，未成熟卵母細(xì)胞獲取容易，常規(guī)IVF周期中平均能得到15%～20%的裸化的未成熟卵［5］，多囊卵巢綜合征（PCOS）患者的未成熟卵母細(xì)胞，婦科手術(shù)穿刺得到未成熟卵母細(xì)胞，良性婦科疾病切除的卵巢組織也都可以得到未成熟卵母細(xì)胞。成熟卵母細(xì)胞染色體排列規(guī)律，胞漿內(nèi)由微管構(gòu)成的紡錘體結(jié)構(gòu)特殊且溫度敏感性高，冷凍降溫中易解聚，造成非整倍體、雙雌受精發(fā)生率高以及透明帶硬化、受精障礙發(fā)生率增加。而未成熟卵母細(xì)胞（GV或MI期）沒有形成紡錘體結(jié)構(gòu)，體積較小且染色體被核膜包繞，GV／MI期卵母細(xì)胞染色質(zhì)特定的存在狀態(tài)在凍融中提供了保護(hù)，染色體損傷的可能性小，對(duì)低溫不敏感，在冷凍過程中易脫水，避免了卵母細(xì)胞因紡錘體結(jié)構(gòu)受到低溫或冷凍保護(hù)劑的沖擊而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)損傷［6］。Al－Khtib等［7］的研究顯示玻璃化冷凍未成熟卵母細(xì)胞在一定程度上并不影響基因的印跡表達(dá)。與成熟卵母細(xì)胞相比，凍存未成熟卵母細(xì)胞是更好的選擇［8］。

二、不同時(shí)期未成熟卵母細(xì)胞特點(diǎn)比較

未成熟卵母細(xì)胞包括GV期和MI期兩大類，GV期卵母細(xì)胞的典型特征是含有1個(gè)巨大的生發(fā)泡，卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)中有兩層大的細(xì)胞膜，即細(xì)胞膜和生發(fā)泡膜。在進(jìn)行冷凍及復(fù)蘇過程中，兩層膜對(duì)滲透壓的變化有著較強(qiáng)的緩沖作用，很大程度上降低了GV期卵母細(xì)胞胞漿膜崩解率，GV期卵母細(xì)胞與MI期相比，更能耐受低溫及冷凍保護(hù)劑的影響，MI期卵母細(xì)胞因不存在生發(fā)泡的特殊結(jié)構(gòu)，而細(xì)胞膜易遭到冷凍破壞［9］。

三、冷凍未成熟卵母細(xì)胞的方法選擇

1.程序化慢速冷凍法：程序化慢速冷凍法是一種經(jīng)典的冷凍方法，比較適合體積大的細(xì)胞。使用低濃度冷凍保護(hù)劑，在程序冷凍儀控制下緩慢降溫使細(xì)胞脫水，利用植冰方法越過細(xì)胞的超冷階段，進(jìn)一步啟動(dòng)脫水過程，在進(jìn)入液氮前使胞漿處于玻璃化狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)未成熟卵母細(xì)胞低溫保存。但程序化慢速冷凍存在脫水不完全的問題，若未成熟卵母細(xì)胞在浸人液氮前還存在小冰晶，小冰晶會(huì)在復(fù)溫過程驟然膨大損傷胞膜及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞致命的傷害。幾十年來，程序化冷凍方法發(fā)展緩慢，其復(fù)蘇率較低，發(fā)育潛能相對(duì)差，文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)的慢速冷凍卵母細(xì)胞來源的出生嬰兒僅約百人［10］。

2.玻璃化冷凍法：玻璃化冷凍作為新興技術(shù)，其基本原理是高濃度冷凍保護(hù)劑溶液以極快的速率降溫，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為類似玻璃形態(tài)的非晶體化固體，這種玻璃化液在低溫時(shí)黏稠度很高，但不結(jié)晶形成玻璃樣固體，保留了正常的超微結(jié)構(gòu)，維持了細(xì)胞內(nèi)外離子、分子分布，很好地解決了程序化冷凍過程中容易去玻璃化和再結(jié)晶導(dǎo)致細(xì)胞損失的問題。在卵母細(xì)胞冷凍方面，Cao等［11］還證明了玻璃化冷凍方法比程序化慢速冷凍卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率、受精率、囊胚形成率高。Smith等［12］的前瞻性對(duì)照研究也得到了相似的結(jié)論，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的胚胎形成率及妊娠率與新鮮卵母細(xì)胞相似［13］。根據(jù)薈萃分析的結(jié)論，程序化慢速冷凍方法的每枚卵母細(xì)胞的出生率為2.3%，玻璃化冷凍方法的每枚卵母細(xì)胞的出生率為5.2%。在未成熟卵母細(xì)胞冷凍的研究上，羅莉等［14］也得到了未成熟卵母細(xì)胞玻璃化凍融組的復(fù)蘇存活率、卵體外培養(yǎng)成熟（IVM）成熟率、受精率及卵裂率均高于慢速程序凍融組的結(jié)論。Catherine等［15］的研究也支持玻璃化冷凍是優(yōu)于程序化慢速冷凍的選擇。另外，玻璃化冷凍操作簡便，節(jié)省人力時(shí)間，不需像程序化冷凍化那樣配備特殊儀器，已經(jīng)成為最有發(fā)展前途的冷凍保存技術(shù)［16］。

四、冷凍保護(hù)劑的選擇

在冷凍過程中添加冷凍保護(hù)劑，達(dá)到延長細(xì)胞脫水過程，避免冰晶的形成，減少冷凍損傷的作用。分為滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑兩大類，滲透性冷凍保護(hù)劑通過降低溶液的冰點(diǎn)，增加溶液的粘性，稀釋溶液中的溶質(zhì)［17］，主要有丙二醇（PROH）、二甲基亞砜（DMSO）和乙二醇（EG）等，三者滲透速率為EG＞PROH＞DMSO，非滲透性冷凍保護(hù)劑不能通過細(xì)胞膜，但可在細(xì)胞外形成滲透梯度，引起胞內(nèi)水分外流，主要有蔗糖、海藻糖、葡萄糖和脂蛋白等。蔗糖是過去常用的非滲透性冷凍保護(hù)劑，添加蔗糖可以提高卵母細(xì)胞細(xì)胞外液滲透壓，促進(jìn)脫水，降低滲透性冷凍保護(hù)劑進(jìn)入到卵母細(xì)胞內(nèi)的量，又能在解凍時(shí)預(yù)防滲透性休克。早期曾認(rèn)為冷凍保護(hù)劑會(huì)導(dǎo)致脫氧核糖核酸突變，DMSO將對(duì)成熟卵母細(xì)胞紡錘體造成較大損害，但新近Milliken等［18］的評(píng)估結(jié)果認(rèn)為DMSO無遺傳毒性，EG沒有直接的遺傳毒性，PROH有導(dǎo)致DNA損傷的可能。現(xiàn)階段未成熟卵母細(xì)胞冷凍的方案研究開始關(guān)注降低冷凍保護(hù)劑的毒性，旨在使用最小濃度的冷凍保護(hù)劑以獲得較穩(wěn)定的解凍復(fù)蘇率。現(xiàn)在普遍認(rèn)為EG能夠有效縮短復(fù)蘇過程中的清除時(shí)間，是較為理想的冷凍保護(hù)劑。Tharasanit等［19］報(bào)道采用逐步分段式冷凍保護(hù)劑在未成熟卵母細(xì)胞冷凍中獲得了較好的結(jié)果。最新Somfai等［20］的研究結(jié)果表明聯(lián)合17.5%PROH和17.5%的EG能夠確保良好的未成熟卵母細(xì)胞復(fù)蘇存活率，且在后期發(fā)育中未觀察到毒性效應(yīng)。

五、冷凍載體的選擇

玻璃化技術(shù)的冷凍載體依據(jù)冷凍物質(zhì)是否直接接觸液氮分為開放性載體和封閉性載體。使用開放性載體，標(biāo)本直接接觸液氮，冷凍復(fù)蘇速度快、效率高，操作簡便，但潛在的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)是其最大缺陷［21］。封閉性載體，如拉細(xì)麥管和冷凍鉤的出現(xiàn)杜絕了污染風(fēng)險(xiǎn)，但較長的封閉操作時(shí)間增加了未成熟卵母細(xì)胞在玻璃化液體內(nèi)的留存時(shí)間，降低了冷凍效率，且復(fù)雜的操作對(duì)人員要求更高。回顧既往有限的幾項(xiàng)有關(guān)使用開放性載體冷凍未成熟卵母細(xì)胞對(duì)其復(fù)蘇存活率、未成熟卵體外培養(yǎng)成熟（IVM）后成熟率、受精率的研究，尚認(rèn)為使用開放性載體可有效保存未成熟卵母細(xì)胞。目前尚缺乏人類胚胎及卵母細(xì)胞經(jīng)液氮感染病毒或其它微生物的報(bào)道，大多數(shù)中心選用冷凍效率較高的開放性載體，有Cryloop、J.Y.straw、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、電鏡銅網(wǎng)等［22］。對(duì)于動(dòng)物研究，在詳細(xì)比較了幾種常用的冷凍載體，綜合評(píng)價(jià)后，認(rèn)為使用小型開放麥管（SOPS）是較好的哺乳動(dòng)物未成熟卵母細(xì)胞冷凍載體［23］。

六、未成熟卵母細(xì)胞先冷凍后培養(yǎng)還是培養(yǎng)成熟再行冷凍

有關(guān)玻璃化冷凍體外成熟培養(yǎng)的人類未成熟卵母細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)方面影響的研究結(jié)果表明先冷凍后培養(yǎng)（vIVM）組與先培養(yǎng)后冷凍（fIVM）組相比，卵母細(xì)胞成熟率低，退化率相對(duì)高［24］。有文獻(xiàn)報(bào)道fIVM組可以達(dá)到與冷凍新鮮成熟卵母細(xì)胞相近的復(fù)蘇率［25］，Yazdanpanah等［26］的研究發(fā)現(xiàn)也與前者相一致。透射電鏡顯示vIVM組皮質(zhì)顆粒CGs大量地減少，同時(shí)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和小的線粒體滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集物。目前普遍傾向于先體外培養(yǎng)成熟后冷凍［27］，已經(jīng)有相關(guān)臨床妊娠的報(bào)道［28］。先養(yǎng)后凍可能會(huì)損失一定量的未成熟卵母細(xì)胞，及時(shí)凍存獲取的未成熟卵母細(xì)胞有可能為患者提供更多的機(jī)會(huì)。綜合考慮，先凍后養(yǎng)仍有一定的應(yīng)用研究價(jià)值。

七、是否保留卵丘顆粒細(xì)胞

卵冠丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間存在著廣泛的連接，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有重要的作用。在冷凍過程中保留顆粒細(xì)胞層是利于還是限制卵母細(xì)胞有多方研究，但仍存有爭議。理論上保留完整地卵冠丘復(fù)合物，會(huì)對(duì)冷凍速率產(chǎn)生影響，顆粒細(xì)胞可能形成一種僵硬結(jié)構(gòu)在冷凍脫水過程中影響卵母細(xì)胞的形態(tài)變化。研究認(rèn)為顆粒細(xì)胞是否存在對(duì)卵母細(xì)胞的冷凍效果無明顯影響［29］，但鑒于卵冠丘細(xì)胞對(duì)復(fù)蘇后未成熟卵的體外成熟的重要作用，主張對(duì)要先行體外培養(yǎng)的未成熟卵母細(xì)胞，要保留完整卵冠丘復(fù)合物。同時(shí)考慮到冷凍復(fù)蘇技術(shù)中顆粒細(xì)胞經(jīng)吹打易脫去或造成細(xì)胞損傷，有引起復(fù)蘇后的未成熟卵體外成熟阻滯的可能性，故在行冷凍復(fù)融操作時(shí)需謹(jǐn)慎把握每個(gè)細(xì)節(jié)。

八、未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的新進(jìn)展

未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)為未成熟卵母細(xì)胞的冷凍技術(shù)提供了技術(shù)基礎(chǔ)，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，IVM 技術(shù)已取得了一定進(jìn)展［30］，從理論上講，很多IVM 培養(yǎng)基已經(jīng)接近體內(nèi)環(huán)境以及提供了與自然生長相似的條件。體外培養(yǎng)時(shí)間、促成熟因子的添加濃度也更精確，新近研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加抗氧化劑［31］、減數(shù)分裂抑制劑等取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。進(jìn)一步優(yōu)化IVM體系，在體外培養(yǎng)過程中盡量保持卵母細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)和功能完整性［32］，將其與未成熟卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)聯(lián)合起來，促進(jìn)核質(zhì)發(fā)育同步是繼續(xù)努力的方向［33］。

九、冷凍保護(hù)因子預(yù)處理

有學(xué)者主張使用冷凍保護(hù)因子（GSF）、抗凍蛋白等減小冷凍損傷，提高冷凍效率。Liang等［34］研究在玻璃化冷凍前使用細(xì)胞松弛素B（CB）預(yù)處理可以提高復(fù)蘇存活率，但并不增加成熟率和胚胎發(fā)育潛能。Sprícigo等［35］主張?jiān)诓ＡЩ鋬銮疤砑幽懝檀驾d體 Methyl－β－cyclodextrin（MβCD），能夠促進(jìn)核成熟，減少玻璃化冷凍或應(yīng)激冷刺激的損傷，同時(shí)提高卵母細(xì)胞質(zhì)膜在玻璃化冷凍中的耐受性，相關(guān)研究不多，尚需更多的數(shù)據(jù)支持。

十、冷凍保存時(shí)間

通常認(rèn)為在液氮（－196℃）條件下，細(xì)胞生物活性處于停滯態(tài)，液氮中唯一的損害因素是外界物理輻射造成的DNA結(jié)構(gòu)破壞。理論上未成熟卵母細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮里是安全的，關(guān)于冷凍胚胎的研究認(rèn)為延長冷凍保存時(shí)間并不影響胚胎質(zhì)量［36］。卵母細(xì)胞冷凍多年后復(fù)蘇，在受精率、卵裂率、胚胎質(zhì)量及發(fā)育能力、種植率和嬰兒出生率方面與新鮮卵母細(xì)胞相比無顯著差異［37］。冷凍未成熟卵母細(xì)胞的保存時(shí)間缺乏相關(guān)報(bào)道，從實(shí)用的角度達(dá)成的共識(shí)一般為3～10年。

自1998年Tucker等［38］首次報(bào)道了GV期未成熟凍融卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟后移植孕育分娩一健康女嬰以來，越來越多的生殖學(xué)家開始關(guān)注未成熟卵母細(xì)胞冷凍保存，盡管該項(xiàng)技術(shù)難度很大，但其應(yīng)用前景廣闊，隨著基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐的不斷推進(jìn)，取得了一定成績，已有數(shù)例妊娠分娩的報(bào)道［39］，但是總體妊振率是很低的。同時(shí)在遠(yuǎn)期安全性評(píng)估方面，IVM及冷凍技術(shù)都可能帶來損傷引發(fā)染色體異常，多精受精和孤雌生殖的可能性相對(duì)增大［40］，目前冷凍對(duì)受精后胚胎的發(fā)育潛能及胚胎著床的影響尚不確切。重視對(duì)此項(xiàng)技術(shù)出生的嬰兒的隨訪，加強(qiáng)遺傳損傷的檢測。可以將未成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存看成由冷凍復(fù)蘇技術(shù)、IVM培養(yǎng)、體外受精及胚胎發(fā)育等組成的一套體系，其中涉及每項(xiàng)技術(shù)都有再完善的空間，特別是IVM技術(shù)與冷凍技術(shù)的結(jié)合增加了技術(shù)難度。總的來看，未成熟卵母細(xì)胞的冷凍技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)很大［41］，需要做更多更深入的基礎(chǔ)與臨床的研究。隨著對(duì)卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)，體內(nèi)成熟及發(fā)育過程的復(fù)雜調(diào)節(jié)近一步認(rèn)識(shí)，IVM培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化以及低溫冷凍保存技術(shù)的完善發(fā)展，理想的未成熟卵母細(xì)胞冷凍方案有望達(dá)成共識(shí)，為女性生育力保存提供技術(shù)支持［42］。

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