灰旱獺-長尾黃鼠鼠疫疫源地監測中應用ELISA檢測F1抗體的可行性分析

熱娜·吐爾地，阿不力米提·買托乎提，布仁明德，阿布力克木·阿不都熱西提，雷 剛，王信惠，廖力夫，徐秉臣

我國的灰旱獺(Marmotabaibacina)-長尾黃鼠(Citellusundulatus)雙宿主鼠疫疫源地，僅分布在北天山北坡，東起沙灣縣的博爾霍拉地區，西到尼勒克縣的恰克蘭尼勒克溝。烏蘇市古爾圖山地牧場(N 44°050～44°20'，E83°22'～83°50') 灰旱獺-長尾黃鼠混居，1964年從自斃長尾黃鼠臟器分離出第一株鼠疫菌，1967年發生1例人間腺鼠疫死亡病例，被定為灰旱獺-長尾黃鼠雙宿主鼠疫疫源地[1]。古爾圖山地牧場在各類鼠疫疫源地中，不僅動物血清鼠疫F1抗體陽性率較高，而且分離的鼠疫菌株也較多[1]。2010-2012年鼠疫監測工作中，應用酶聯免疫吸附試驗夾心法(ELISA)與間接血凝試驗(IHA)檢測鼠疫F1抗體，本文報告兩種方法的檢測結果并討論ELISA鼠疫監測中的應用前景。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本 鼠疫監測工作中釆集的灰旱獺、長尾黃鼠和牧犬血清，加硫柳汞防腐，4 ℃保存備用。

1.1.2試劑 間接血凝試驗檢測鼠疫菌F1抗體診斷試劑盒：吉林博德醫學免疫制品有限公司，批號：20100101，20110115，20111215；酶聯免疫吸附試驗檢測鼠疫菌F1抗體診斷試劑盒：新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心，蘭州生物制品研究所研制，批號：20100315，20110501，20120103。

1.1.3儀器 酶標儀(Multiskan Mk3) 上海熱電儀器有限公司；洗板機(WELLWASH 4MK2) 上海賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1IHA檢測鼠疫F1抗體(微量法) 微量血凝板管底為90°角V形，試驗在28～37 ℃進行，設陽性、陰性對照。初篩：每份標本6管，每管加稀釋液25μL，首管加標本25 μL，連續2倍稀釋到最末管；每管加1%F1抗原致敏血細胞液25 μL，旋轉振蕩1 min，28～37 ℃靜置90 min，觀察結果，凝集血細胞布滿管底為陽性反應終點。驗證：包括測滴度試驗和抑制試驗，滴度試驗列每管加稀釋液，抑制試驗列加含鼠疫F1抗原稀釋液，首管加復檢標本，連續2倍稀釋到最末管；以下操作步驟同初篩試驗。滴度試驗的陽性反應滴度比抑制試驗高2個或2個以上滴度為驗證試驗陽性，判為鼠疫F1抗體陽性反應，滴度用1∶2n表示，n為陽性反應終點管數[2]。

1.2.2ELISA檢測鼠疫F1抗體 試驗在28～37 ℃進行，設陽性、陰性對照。初篩：鼠疫F1抗原反應板每管加稀釋液50 μL；每管加1份標本50 μL，靜置90 min；流水沖洗5次；加酶標Fl抗原液100 μL，反應45 min，流水沖洗5次加TMB顯色液A液B液，避光反應15 min，加終止液，陰性為無色或顏色很淡。觀測記錄結果：目測：距白色背景15～20 cm，從上方向下觀察，陰性(-)無色或顏色很淡，陽性(+)顏色明顯可見；比色計比色：雙波長450 nm/630 nm，標本OD值>0.2為陽性反應。驗證：初篩陽性反應標本做驗證試驗，滴度試驗列加稀釋液，抑制試驗列加含鼠疫F1抗原的稀釋液，兩列的首管加同份標本，連續2倍稀釋；以下操作步驟同初篩試驗。標本OD >0.20為陽性反應滴度終點，滴度用1∶2n表示，n為陽性反應終點管數。檢測滴度試驗比抑制試驗滴度高2個或2個以上滴度為驗證試驗陽性，判為鼠疫F1抗體陽性[2]。

1.2.3鼠疫細菌學檢驗 包括顯微鏡檢查，分離培養，噬菌體裂解試驗，和動物試驗四個步驟[2]。

1.2.4統計方法 用SPSS 16.0統計軟件，顯著性檢驗，陽性率用χ2檢驗，陽性反應幾何平均滴度用t檢驗。

2 結 果

2.1鼠疫F1抗體陽性率比較 烏蘇市古爾圖地區2010-2012年，灰 旱 獺、長尾黃鼠和牧犬血清，用ELISA和IHA檢測血清鼠疫F1抗體，結果見表1。ELISA和 IHA檢測血清鼠疫F1抗體，長尾黃鼠血清的陽性率分別為11.71%(118/1008) 和1.73% (21/1216)，差異非常顯著(χ2=93.67,P<0.001)；牧犬血清的陽性率分別為38.89% (28/72) 和10.71% (7/75) ，差異非常顯著(χ2=18.56,P<0.001)。檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體，ELISA的陽性率高于IHA。

2.2鼠疫F1抗體滴度分布 ELISA和IHA兩種方法檢測2010-2012年間的血清鼠疫F1抗體，陽性反應滴度分布列于表2，以ELISA的陽性標本數計算兩種方法的平均滴度。檢測長尾黃鼠血清鼠疫F1抗體， ELISA和IHA的平均滴度分別為27.805(s 23.427)和21.254(s 22.832)，差異非常顯著(t=51.38P<0.001)；牧犬血清鼠疫F1抗體平均滴度分別為27.731(s 22.736)和21.50(s 22.611)，差異非常顯著(t=14.034P<0.001)。

2.3檢驗鼠疫菌結果 鼠疫細菌學監測數據見表3。從病死灰旱獺中分離的2株鼠疫菌，跳蚤分離的鼠疫菌株較多，受跳蚤保存液中結晶紫質量和保存時間的影響，不同年份的檢出率差異較大；長尾黃鼠鼠疫菌檢出率較高，且檢出率較穩定。長尾黃鼠鼠疫菌檢出率與F1抗體陽性率比較見表4。

3 討 論

ELISA是目前多種疾病監測中最常用的方法，已成為國際主流技術，敏感性和特異性大大高于IHA[3]。在鼠疫監測中，ELISA已經成為采用國家最多的抗體檢測方法，一些新近開展鼠疫監測的國家，在國際組織的支持下也開始使用這種方法[4-5]。我國在5年前，就把ELISA和IHA檢測鼠疫F1抗體列入了鼠疫診斷標準(WS279-2008)[2]。

ELISA檢測鼠疫F1抗體試劑盒，25 ℃以下陰涼處保存60 d效價穩定，沖洗步驟洗去與特異性反應無關的物質，排除溶血和腐敗物質的干擾。酶標抗原催化底物的顯色反應，顯示F1抗體的含量。鼠疫F1抗原致敏紅細胞是IHA檢測鼠疫F1抗體的關鍵試劑，混懸液中醛化紅細胞吸附F1抗原的量和牢度，對溫度、pH值、離子種類和強度的變化十分敏感，野外現場工作中運輸和保存試劑，經常偏離適宜條件，導致F1抗原從醛化紅細胞表面脫落，試劑的效價降低甚至完全失效。抑制試驗只能降低特異性凝集滴度，而不改變非特異性凝集滴度。IHA檢測嚴重溶血、腐敗標本，常出現高滴度非特異性凝集，低滴度特異性凝集被高滴度非特異性凝集掩蓋，這是IHA檢測鼠疫F1抗體滴度分布缺乏低滴度陽性的主要原因。檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體，ELISA的陽性率是IHA的6.77倍(χ2=73.67,P<0.001)和3.63倍(χ2=18.56,P<0.001)，ELISA的幾何平均滴度是IHA的6.22倍(t=51.38,P<0.001)和5.15倍(t=14.034,P<0.001)。ELISA和IHA檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體的敏感性差異非常顯著。

IHA與ELISA檢測鼠疫F1抗體陽性率顯著性檢驗：長 尾 黃 鼠：χ2=73.67P<0.001 牧 犬：χ2系希臘文=18.56P<0.001.

Note: The significance between IHA and ELISA in detecting plague F1 antibody:Citellusundulates--χ2=73.67,P<0.001; husbandry dog--χ2=18.56,P<0.001.

表2 兩種方法檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體滴度分布

IHA與ELISA檢測鼠疫F1抗體平均滴度顯著性檢驗：長尾黃鼠t=51.38P<0.001 牧犬t=14.034P<0.001.

Note: The significance between IHA and ELISA in detecting the average titer of plague F1 antibody:Citellusundulates--t=51.38,P<0.001, husbandry dog--t=14.034,P<0.001.

表3 烏蘇市古爾圖地區檢驗鼠疫菌結果

表4 ELISA和IHA長尾黃鼠F1抗體陽性率與檢菌陽性率比較

細菌學方法分離鼠疫菌和免疫學方法檢測鼠疫F1抗體，都是鼠疫監測的重要內容，分離鼠疫菌試劑穩定，技術成熟，實驗動物為清潔級小白鼠，表3顯示長尾黃鼠臟器鼠疫菌檢出率高，且檢出率穩定。表4顯示長尾黃鼠F1抗體陽性率與鼠疫菌檢出率的比值，ELISA比值大、波動小(8.016～8.714)，IHA比值小、波動大(0.528～1.649)，提示ELISA檢測長尾黃鼠F1抗體是灰旱獺-長尾黃鼠鼠疫疫源地監測的敏感穩定的指標。

我國開展鼠疫監測較早，至今仍沿用2005年的全國鼠疫監測方案，該監測方案檢測鼠疫F1抗體只有IHA一種方法。為了能與世界同步，與周邊國家的監測結果相比較，我國也應當在監測中推廣ELISA檢測抗體方法[6]。依照新版鼠疫診斷標準(WS279-2008)修訂鼠疫監測方案，增加ELISA檢測抗體方法，不僅附合方案服從標準的原則，而且可提高鼠疫診斷的準確性，減少根據錯誤檢驗結果實施防控措施的損失。在灰旱獺-長尾黃鼠鼠疫疫源地監測中，應用ELISA和 IHA檢測血清鼠疫F1抗體，為修訂全國鼠疫監測方案提供實驗數據和參考資料。

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