一種烏鱧與斑鱧線粒體PCR-RFLP鑒定方法

董傳舉張松皓陳坤慈宋迎楠徐鵬孫效文

（1.中國水產科學研究院生物技術研究中心，北京 100141；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3.中國水產科學院珠江水產研究所，廣州 510380）

一種烏鱧與斑鱧線粒體PCR-RFLP鑒定方法

董傳舉1，2張松皓1陳坤慈3宋迎楠1，2徐鵬1孫效文1

（1.中國水產科學研究院生物技術研究中心，北京 100141；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3.中國水產科學院珠江水產研究所，廣州 510380）

為了高效的鑒別烏鱧與斑鱧，采用PCR-RFLP技術，對烏鱧與斑鱧開展分子生物學鑒定方法研究。通過比對烏鱧和斑鱧線粒體全序列，發現1處單核苷酸多態性位點，可以明確區分兩個物種。利用1對引物對烏鱧與斑鱧線粒體基因組該區域進行PCR擴增，用限制性內切酶EcoR I分別對擴增產物進行酶切，并用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測酶切結果。PCR-RFLP檢測結果顯示，斑鱧的PCR擴增產物被EcoR I酶切后生成兩個不同大小的片段，分別為315 bp和875 bp，烏鱧則保持不變。由此可將烏鱧與斑鱧在酶切圖譜上鑒別出來。

烏鱧 斑鱧 線粒體基因組 PCR-RFLP 鑒定

烏鱧（Channa argus），鱸形目（Perciformes）鱧科（Channidae）鱧屬（Channa）魚類，俗稱黑魚，又名北方蛇頭魚、烏魚、烏棒、蛇頭魚、文魚和才魚，是我國特有的名特優淡水魚類，在我國廣泛分布。烏鱧肉質細嫩，口味鮮美，且營養價值頗高，在國內市場廣受歡迎，目前在我國被廣泛養殖，具有較高的經濟價值。斑鱧（C.maculata）與烏鱧同屬于鱧科鱧屬，從形態學方面與烏鱧類似，從形態學鑒定有時并不一定準確，存在很強的主觀因素，尤其是在苗種期或者食品加工處理后的區分和鑒定比較困難。由于消費習慣、養殖環境、營養價值和養殖成本等原因，烏鱧和斑鱧的市場價值具有較大差異。鑒于此，亟須開發出能夠快速鑒定烏鱧和斑鱧的分子檢測技術，用于市場監管、種質鑒定等用途。

線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）作為真核細胞的核外遺傳因子，復制方式相對比較簡單，遵從嚴格的母系遺傳，在世代傳遞過程中不發生重組現象，并且結構基因排列緊湊，沒有間隔序列和內含子，編碼效率高于核DNA。mtDNA的進化速率是核DNA的5-10倍，且缺少有效的DNA損傷修復機制，還有突變累加效應［1］?？截悢盗慷?，很容易從組織中分離純化。并且基因片段大小適中，種間進化速率較快，對于探索物種系統發育極為有效［2］。mtDNA序列的差異可以表明遺傳群體在進化過程中的分離，單倍型頻率可以揭示地理種群間的轉移［3］。由于線粒體DNA的這些特點，mtDNA序列也更多地用于研究馴養動物的親緣關系、起源及其多樣性，如兔子、豬、山羊、水牛和馬等［4-9］。PCR-RFLP技術是最早的分子標記技術之一，指基于限制性內切酶消化不同長度的限制片段的多態現象在mtDNA分析中廣泛使用，由于擴增總DNA，所以可以有效避免純化mtDNA的繁瑣步驟，并且可以通過PCR方法很好地控制DNA片段大小，酶切位點數及擴大模板量，適用于微量組織樣品的分析。由于該技術結果可靠、準確、具有較高的穩定性，并且檢測中僅需要少量的組織材料，所以適用于對物種各個發育階段的鑒別研究［10］。

鱧科魚類是一種頗受歡迎的淡水名貴經濟魚類。我國是一個盛產烏鱧的國家，目前對烏鱧已進行了大量的研究，在行為學、光照對其攝食的影響、最適溫度、繁殖特性和苗種培育、生活史、組織器官的發生和發育、營養需求、營養價值以及核型分析和雜交育種等各個方面都有所研究［11-21］。而對斑鱧的研究報道相對少得多，僅見人工繁殖和苗種培育、營養需求和營養價值等方面的研究［22，23］。本研究通過對烏鱧與斑鱧的線粒體進行比對分析，找出差異位點，利用PCR-RFLP技術快速鑒定，旨在為瓊脂糖凝膠電泳酶切產物快速準確的鑒定烏鱧和斑鱧提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究利用中國水產科學研究院珠江水產研究所提供的烏鱧和斑鱧，活體剪取尾鰭一小部分放入1.5 mL離心管中，-80℃保存。儀器與試劑：限制性內切酶和PCR試劑均購置于NEB（北京）有限公司，引物由生工生物工程公司合成，其他試劑均為國產分析純。PCR儀為Applied Biosystem 9700（Life Technologies）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 分別剪取10尾烏鱧和10尾斑鱧的尾鰭各0.5 g，剪碎，放入1.5 mL離心管中并分別編號：1-10為烏鱧，11-20為斑鱧，應用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，乙醇沉淀，-20℃貯存備用。

1.2.2 引物設計 根據文獻調研和檢索GenBank數據庫獲取了烏鱧和斑鱧的線粒體基因組序列［24，25］，兩個基因組序列編號分別為JX978723（烏鱧）和KC310861（斑鱧）。應用MEGA5.1軟件［26］對烏鱧和斑鱧線粒體基因組序列進行比對發現，在第3 126 bp位置存在單堿基差異，并且該位點為限制性內切酶EcoR I識別位點。基于此，我們在該位點兩側相對保守區域，利用Primer5.0軟件設計引物序列，對包含該單核苷酸多態性位點的線粒體基因組序列區域進行擴增。

1.2.3 線粒體DNA的PCR擴增 提取的線粒體DNA使用設計的引物進行擴增。PCR反應體系為20 μL：0.5 μL 濃度為2 500 U/mL的TaqDNA聚合酶，2 μL 10×PCR緩沖液，3.2 μL濃度為10 pm/μL的dNTPs，1 μL所述基因組DNA，0.5 μL濃度為10 pm/μL的上游引物No.1，0.5 μL濃度為10 pm/μL的下游引物No.2，12.3 μL無菌水。

PCR擴增反應為：94℃預變性 5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存備用。

1.2.4 限制性內切酶EcoR I的酶切反應 所述酶切反應體系為20 μL：2 μL 上述PCR產物，2 μL 10×酶切緩沖液，1 μL濃度為20 000 U/mL 的EcoR I限制性內切酶，15 μL無菌水，所述酶切反應體系在37℃反應30 min，獲得酶切產物。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產物和酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，電泳結束后，用凝膠圖像處理系統采集電泳圖，收集數據并分析。

2 結果

2.1 序列比對結果和引物設計

應用MEGA5.1軟件對烏鱧和斑鱧的線粒體基因組序列進行比對，發現烏鱧與斑鱧的線粒體DNA在第3 126 bp位置存在單核苷酸多態性。而在斑鱧中，該位置位于限制性內切酶EcoR I識別位點區域（第3 122 bp和第3 123 bp堿基之間的磷酸二酯鍵為限制性內切酶EcoR I酶切位點）；由于單核苷酸多態性位點的差異，烏鱧無限制性內切酶EcoR I酶切位點（圖1），故可以通過限制性內切酶EcoR I對上述擴增片段進行酶切，從而對烏鱧與斑鱧進行區分和鑒別。

通過Primer5.0設計引物（表1）進行PCR擴增，可以得到線粒體基因組2 807-3 997 bp之間的區域。該擴增片段位于線粒體DNA的tRNA-Leu和tRNAGln之間，包括部分tRNA-Leu和tRNA-Gln區域以及全部NADH dehydrogenase subunit I區域和tRNAIle區域，酶切位點位于NADH dehydrogenase subunit I上。

2.2 PCR擴增結果

通過上述引物的PCR擴增，烏鱧與斑鱧線粒體DNA均擴增出單一的片段，未發現其片段長度多態性，如圖2所示。

2.3 酶切結果分析

限制性內切酶EcoR I酶切結果，如圖3所示。

將圖2和圖3進行比較，可見圖2中烏鱧樣本（1-10）的條帶經過酶切后在圖3中（1'-10'）沒有發生變化，說明沒有發生酶切，圖2中斑鱧樣本（11-20）的條帶位置和數量在圖3中（11'-20'）發生了變化，說明發生了酶切反應。上述酶切位點為距離斑鱧擴增多核苷酸序列5'的第315和第316個堿基之間的磷酸二酯鍵，而所述烏鱧擴增多核苷酸序列5'的第315和第316個堿基之間的磷酸二酯鍵不會發生酶切。所以通過酶切反應，將斑鱧所述PCR產物（1 190 bp）包含的DNA分子切成了兩段

DNA分子，大小分別為315 bp和875 bp（表2）。

3 討論

基于線粒體序列開發高效準確的分子鑒定方法也廣泛應用于對許多水產品易混物種的鑒定中。例如，Aoyama等［27］利用線粒體DNA的PCR-RFLP技術開發了歐洲鰻鱺和亞洲鰻鱺的快速鑒定方法；Karaiskou等［28］利用線粒體DNA的PCR-RFLP技術對竹莢魚屬3個種進行了成功的分子鑒定等；莊怡等［29］利用PCR-RFLP技術對鯽魚6個不同品系成功的進行鑒定；王淞等［30］對3個長江野生群體以及一個人工繁殖群體，共158尾鰱mtDNA D-loop區段進行PCR-RFLP分析，從而鑒定4個不同群體的差異；吳海防等［31］采用PCR技術對江西瑞昌、湖南長沙、天津寧河3個群體的144尾草魚線粒體DNA（mtDNA）D-Loop區段的限制性片段長度多態性（RFLP）進行了分析，得出草魚mtDNA D-Loop區段的遺傳多樣性較低的結論；文菁等［32］基于570 bp左右的線粒體16S rRNA基因片段，利用3種核酸內切酶（DdeI，HaeIII和StyI）對16種海參PCR產物進行酶切，分別產生10種、5種和5種單倍型，通過單倍型的組合，即能有效區分16種海參的種類。

僅依據形態學鑒定并不能準確區分烏鱧與斑鱧，從而造成相互混雜，直接影響育種效果。烏鱧與斑鱧mtDNA的結構十分簡單，并且與其它脊椎動物的線粒體基因基本相同［33］：一個mtDNA控制區（D -Loop區），13個蛋白質基因，其中一個是細胞色素b基因（cyt b）；兩個是ATP酶亞基的基因（ATPase6, ATPase 8）；3個是細胞色素氧化酶的基因（CO I、CO II和CO III）；7個是呼吸鏈NADH脫氫酶亞基的基因（ND1-6和ND4L），有兩個rRNA基因，一個是12S rRNA，一個是16S rRNA，22個tRNA基因。因此，本研究利用斑鱧和烏鱧純種資源，通過線粒體序列的比對分析，發掘斑鱧和烏鱧的特異性多態性標簽，開發一種基于PCR-RFLP技術的快速種質鑒別方法。

烏鱧與斑鱧線粒體PCR-RFLP鑒定方法表明：提取待檢測樣本的DNA，設計一對相同的引物就可以擴增出烏鱧與斑鱧的mtDNA片段，并且根據該區域mtDNA的一個SNP位點的不同，通過限制性內切酶EcoR I進行酶切，由于斑鱧在該區域具有限制性內切酶EcoR I酶切位點，所以酶切后生成特異的兩條帶；而烏鱧在該區域不具有酶切位點，故酶切后仍為一條帶，從而瓊脂糖凝膠電泳后便可以把烏鱧與斑鱧鑒別出來。本方法通過PCR擴增片段的限制性酶切，得到的限制性酶切圖譜，不但為烏鱧與斑鱧的鑒定提供了分子標記，同時也為進一步構建物理圖譜，進化遺傳學和育種研究打下了基礎；更有利于實際生產部門，科研部門快速鑒定所取樣本，提高了工作效率。

該方法不僅操作簡單，而且在保證魚種存活基礎上只需剪取少量鰭條，或者采集少許冷凍魚肉或魚糜提取DNA，便可快速準確的鑒別出烏鱧和斑鱧，鑒定結果準確可靠，在群體遺傳學、分子生態學和水產品質量鑒定等方面均有較大的應用前景。

4 結論

本研究利用烏鱧和斑鱧線粒體之間的差異，設計引物對包含該差異位點的區域進行擴增。對擴增片段應用限制性內切酶EcoR I酶切，并對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果中，電泳條帶為一條的為烏鱧，兩條的為斑鱧。根據條帶的數量，便可以鑒定出烏鱧與斑鱧。

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（責任編輯 狄艷紅）

A PCR-RFLP Method for Channa argus and Channa maculate Discrimination

Dong Chuanju1，2Zhang Songhao1Chen Kunci3Song Yingnan1，2Xu Peng1Sun Xiaowen1
（1. The Centre for Applied Aquatic Genomics，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；2. College of Life Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；3. Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380）

In order to identificate Channa argus and C. maculate efficiently. We developed a PCR-RFLP method to conduct research in molecular biology. Briefly, two genomes of C. argus and C. maculate were aligned and compared, a SNP was identified which can discriminate two Channa species. A pair of primers was designed to amplify the mitochondrial DNA of both species, then digested by restriction enzyme EcoR I and test the digestion result by agarose gel of 1.5%. The result showed that the PCR product of C. maculate was digested by EcoR I that generate two fragments of 315 bp and 875 bp, while the PCR product of C. argus can not be digested by EcoR I. Thus, two Channa species were clearly discriminated.

Channa argus Channa maculate mtDNA PCR-RFLP Identification

2014-01-03

國家“863計劃”項目（2011AA100401），農業部公益性行業科研專項項目（200903045）

董傳舉，男，博士研究生，研究方向：水產基因組學；E-mail：cjd1989@126.com

徐鵬，男，研究員，研究方向：水產基因組學；E-mail：xupeng@cafs.ac.cn