正交試驗優化八角ISSR-PCR反應體系

馮丹寧德魯陳少瑜李勇杰張艷麗吳濤陳海云

（1.云南省林業科學院，昆明 650201；2.云南省森林植物培育與開發利用重點試驗室 國家林業局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點試驗室，昆明 650201）

正交試驗優化八角ISSR-PCR反應體系

馮丹1，2寧德魯1陳少瑜1，2李勇杰1張艷麗1吳濤1，2陳海云1

（1.云南省林業科學院，昆明 650201；2.云南省森林植物培育與開發利用重點試驗室 國家林業局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點試驗室，昆明 650201）

利用正交試驗設計研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物（UBC 886）、dNTP、Mg2+濃度5個因素對云南八角ISSR-PCR反應的影響，建立其最佳反應體系。結果表明：25 μL的反應體系中5個因子的最佳水平為：Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸1 min，40次循環；72℃最后延伸7 min，4℃保存。

八角 ISSR-PCR反應 正交設計 體系優化

八角（Illicium verumHook. f.）是我國南方重要經濟林木之一，其干果和茴油為我國傳統的出口產品。同時，八角中的莽草酸是制造抗病毒藥物奧司他韋的合成原料之一，特別用于流感的防治，2009年的H1N1新流感及2013年H7N9流感亦使用奧司他韋作治療［1］。中國八角干果90%來自廣西和云南，截至2011年底，全國八角干果年產量13.32萬t，而廣西、云南產量總和占全國總產量的93.62%［2］。因而，發展八角產業，對推動西部暖濕山區農民致富，改善生態環境具有重要意義。云南八角種質資源極為豐富，實生群體分布廣泛，在早實、豐產、質優、抗性好的果實品質等方面具有豐富的多樣性。這些豐富的種質資源不僅是新品種選育的物質基礎，同時也是八角產業可持續發展的物質基礎?？茖W合理地保護開發和利用這些豐富的種質資源，對八角產業的可持續發展具有重要的意義。

我國學者已從形態特征及分布、良種選育、栽培管理和病蟲害防治等方面對八角做了大量研究工作［3-5］，利用分子生物技術對八角展開研究是近一年來才開始的，且僅限于用AFLP［6］和RAPD［7］進行八角遺傳多樣性分析。簡單重復序列間區標記（ISSR）是一種在PCR中直接使用微衛星序列進行DNA擴增的分子標記技術［8］。由于ISSR技術具備操作簡單、快速、高效、重復性好、耗資低等特點，近年來被廣泛應用于植物的遺傳連鎖圖譜構建、種質資源鑒定、基因鑒定和植物分類等各方面工作［9］。但是，對于不同的物種，反應體系的各因子的濃度將影響擴增結果?；诖耍驹囼炦x擇云南省不同地區的八角作為試驗材料，采用正交設計對反應體系中Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs等5個因子進行試驗和分析，旨在摸索出一個適合八角ISSR-PCR反應的最佳體系，為八角今后相關的分子遺傳分析工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來源于云南省文山州麻栗坡縣、廣南縣和富寧縣3個居群。DNA提取參照陳海云［10］的方法。用微量紫外分光光度計和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA進行檢測，根據DNA模板濃度梯度稀釋結果［11］，DNA模板濃度調至2×10-3ng/μL。隨機從以上4個居群中分別取出兩個單株，等量混合后作為ISSR-PCR反應的DNA模板。

TaqDNA聚合酶、MgCl2等試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的ISSR引物序列，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。經引物初步篩選，選擇有擴增產物但效果欠佳的UBC886（3'-VDVCTCTCTCTCTCTCT-5'）作為ISSR-PCR體系優化引物。

1.2 方法

1.2.1 ISSR-PCR體系的正交設計 本試驗采用5因素4水平正交試驗設計［12］，TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物和DNA模板的各濃度梯度，見表1，正交試驗共25個反應體系（表2）。反應總體積為25 μL，各體系中均加入2.5 μL的10×PCR buffer，其他各因素按表2加樣，用ddH2O補足25 μL，用20 μL滅菌礦物油覆蓋。

反應在Bio Rad C1000 Touch PCR基因擴增儀上進行。PCR擴增反應的程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環40次；72℃延伸7 min，12℃保存。

1.2.2 反應體系和擴增程序穩定性檢測 擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為0.5×TBE，將擴增產物與溴酚藍指示劑按照6∶1混合后取10 μL加入點樣孔，以5 μL的D2000（天根）為Marker，120 V恒壓電泳90 min，用Gene Genius Bio凝膠成像系統拍照分析。用3個不同種源的12個云南八角單株檢測最佳反應體系和程序的穩定性。1.2.3 數據處理 根據電泳圖為每個處理中的可識別條帶賦值，將有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，采用SPSS19.0進行極差分析和方差分析，同時參考條帶的亮度和背景清晰度進行判斷，選出最佳體系。

2 結果

2.1 正交試驗分析

2.1.1 正交試驗擴增的電泳圖譜直觀分析 八角ISSR-PCR正交試驗電泳圖如圖1所示，由于不同處理間Mg2+、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs濃度不同，ISSR-PCR的擴增結果也有明顯的差異。處理組合2、4、17、18和24擴增條帶明亮，背景較為清晰。其中處理組合2（A3B3C1D1E4）和4（A3B1C4D4E1）的擴增主帶明亮，背景清晰，表明這兩個處理在八角ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計中效果最佳。

2.1.2 正交試驗數據分析 根據電泳圖為每個處理中的可識別條帶賦值（表2），將有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，然后對正交試驗進行極差分析，結果見表3。極差分析中，Ki（i= 1，2，3和4）代表各因素同一水平下的條帶數之和，R表示同一因素不同水平間的極差值。極差值反映了每個因素對ISSR-PCR 反應的影響程度，R值越大，說明該因素對試驗結果影響越大。從極差R值可以看出，dNTPs和DNA模板對八角ISSR-PCR反應的影響最大，極差值為25；其次是引物，極差值為18；Mg2+和TaqDNA聚合酶的極差值均小于空白組的極差值，分別為16和17。各因素的主效應對八角ISSR-PCR反應影響的順序為：dNTPs＞DNA模板＞引物＞TaqDNA聚合酶＞Mg2+濃度。

為進一步確定各因素對八角ISSR-PCR反應正交試驗的影響，本試驗利用SPSS19.0進行了方差分析和多重比較。結果（表4）表明，Mg2+濃度和引物對試驗結果的影響達到顯著水平（P＜0.05），而DNA模板、TaqDNA聚合酶和dNTPs對試驗結果的影響未達到顯著水平（P＞0.05）。多重比較結果表明，Mg2+濃度在水平1時，擴增條帶少且背景模糊，與其他3個水平間存在顯著差異，當Mg2+濃度達到2-4 mmol/L之間時，擴增條帶較多，其中Mg2+濃度在3 mmol/L時，擴增條帶明亮，背景清晰；引物濃度在0.6-0.8 μmol/L范圍內時，擴增條帶最多，結合主帶亮度和背景清晰度等方面考慮，引物的最適濃度為0.8 μmol/L；TaqDNA聚合酶在1.5-2.0 U時對正交試驗結果影響顯著，但是結合極差分析中各因素對正交試驗結果影響的排序，TaqDNA聚合酶的最適濃度為0.5 U。綜上所述，在25 μL的八角ISSR-PCR體系中，5個因素的最佳組合為A3B1C4D4E1，即Mg2+濃度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L。

2.2 ISSR-PCR系統穩定性檢測

根據正交試驗和方差分析得到最佳優化體系（A3B1C4D4E1），隨機選擇12個八角單株（每個居群各4株）進行擴增，以便進一步檢測該反應體系的穩定性。結果（圖2）表明，12個單株均能獲得清晰、多態性高、重復性好的條帶，表明本試驗正交設計優化八角ISSR-PCR反應體系穩定可靠。

3 討論

目前，八角分子標記和基因序列方面的研究僅限于潘曉芳等［6］對八角屬8個種和八角47個品種（類型）進行的AFLP遺傳多樣性分析，陳海云等［7］基于RAPD技術對云南23個八角優良無性系進行的遺傳多樣性分析，劉文倩等［14］用核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS）序列對披針葉八角（I. laceolatum）進行的聚類分析。本研究初始根據已報道的八角屬的地楓皮（I. difengpi）［15］和黃花八角（I. parviflorum）［16］ISSR反應體系建立八角ISSR-PCR試驗體系時，未能得到理想的擴增結果，先通過單因素試驗［11］獲知八角DNA模板用量遠低于普通ISSR-PCR反應體系時方能得到較為滿意的結果。在此基礎上，進一步通過正交試驗設計獲得了理想的擴增結果。

由于ISSR-PCR分子標記技術的擴增結果受引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+濃度和dNTPs濃度等多種因素的影響，且各因素間又可能存在互作效應，因此確定最適八角ISSR-PCR體系就顯得尤為必要。前人研究表明，DNA模板為102-105拷貝數時有利于ISSR-PCR試驗［13］，所以，當本試驗正交優化設計最終選用0.016 ng的DNA模板時，ISSR-PCR反應取得了較好的擴增效果。為獲得重復性好、可靠性高的擴增譜帶，本試驗還通過正交試驗對影響八角ISSR-PCR反應的其他4個因素Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、引物和dNTPs在4個不同的濃度水平上進行了優化。Mg2+和dNTPs是TaqDNA聚合酶活性所必需的因素，兩者之間能相互結合形成復合物，dNTPs濃度過低會降低PCR產物的產量，過高會造成浪費，且會降低Mg2+的有效濃度［13］。此外，引物濃度和TaqDNA聚合酶濃度也是PCR特異性反應的關鍵，二者濃度過高可能產生非特異性擴增產物，而濃度過低則會影響擴增效果?？傊琈g2+濃度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs各因素對PCR反應的影響既獨立又互補。因此，今后在設計正交試驗時，不但應兼顧各因素主效應，同時還應該考慮各因素間可能存在的交互作用，以便獲得條帶明亮、背景清晰、可靠性高的擴增圖譜。

4 結論

通過直觀、極差、方差和多重比較，最終確定了處理4，即Mg2+濃度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L為最佳的水平組合。

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（責任編輯 狄艷紅）

Optimization of ISSR-PCR Reaction System of Anise（Illicium verum Hook. f.）Based on Orthogonal Design

Feng Dan1，2Ning Delu1Chen Shaoyu1，2Li Yongjie1Zhang Yanli1Wu Tao1，2Chen Haiyun1
（1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201；2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants，Yunnan Laboratory for Conservation of Rare，Endangered & Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration，Kunming 650201）

Based on orthogonal design experiments, five main factors in ISSR-PCR amplification system, including Mg2+concentration, Taq DNA polymerase, DNA template, primer（UBC 868）and dNTPs, were studied to optimize the system for Illicium verum Hook. f.. The results showed that the optimized system was a total volume of 25 μL containing 3 mmol/L Mg2+, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.016 ng DNA template, 0.8 μmol/L primer and 0.2 mmol/L dNTPs. The optimal amplified procedure was started with predegeneration at 94℃ for 5 minutes, followed by 40 cycles of 30 seconds for denaturalization at 94℃, 45 seconds of annealing at 46℃, 60 seconds of extension at 72℃；7 minutes of extension at 72℃ and indefinitely remain at 4℃.

Illicium verum Hook. f. ISSR-PCR Orthogonal design Reaction system

2013-11-15

云南省“十一五”科技攻關項目（2006NG26），云南省自然科學基金項目（2010ZC234）

馮丹，女，碩士，研究實習員，研究方向：林木遺傳育種；E-mail：fengdan1220@hotmail.com

陳海云，女，副研究員，研究方向：經濟林良種選育及栽培；E-mail：kmchenhy@163.com吳濤，男，博士，助理研究員，研究方向：林木遺傳育種；E-mail：ynafwt@126.com