橡膠樹轉基因植株Southern雜交體系的優化

李季魯旭，2黃天帶華玉偉黃華孫

（1. 中國熱帶農業科學院橡膠研究所 農業部橡膠樹生物學重點開放實驗室，儋州 571737；2. 海南大學農學院，海口 570228）

橡膠樹轉基因植株Southern雜交體系的優化

李季1魯旭1，2黃天帶1華玉偉1黃華孫1

（1. 中國熱帶農業科學院橡膠研究所 農業部橡膠樹生物學重點開放實驗室，儋州 571737；2. 海南大學農學院，海口 570228）

以地高辛標記的Southern雜交技術已廣泛應用于多個物種中。選擇橡膠樹為材料，就基因組DNA的提取、探針標記方法的選擇以及具體的雜交操作過程等方面對該體系進行了優化。結果表明，至少40 μg高質量的DNA在300 μL的大酶切體系中，酶切12 h可獲得良好效果；PCR法標記的探針雜交條帶清晰、背景淺，其效率明顯強于隨機引物法標記的探針。本研究優化的體系信號強、背景淺和靈敏度高，為橡膠樹Southern雜交鑒定分析提供參考。

橡膠樹 轉基因 Southern blot 地高辛 PCR法標記

Southern印跡雜交技術因其高靈敏度、高特異性已成為檢測關鍵性DNA片段的經典方法之一［1］，目前廣泛應用于分子生物學和基因工程等研究領域。Southern雜交探針分為放射性和非放射性兩類［2］，早期以同位素標記的放射性探針為主，具有較高的靈敏度和特異性，但存在半衰期，易造成放射性污染。非放射性地高辛（DIG）標記探針具有敏感性高、方便、安全和探針儲存期長等優點，得到了廣泛的應用［3-5］。探針標記的方法主要有隨機引物延伸標記法、缺口平移法、末端標記法、PCR法和熒光標記法等。但其中最為常用是PCR標記法和隨機引物法［6］。目前棉花［7］、煙草［8］、水稻［9］、油菜［10］、小麥［11］等植物利用地高辛標記的Southern雜交均獲得較好的雜交效果，而橡膠樹基因組結構較為復雜［12］，同位素探針標記的Southern雜交技術雖已成功應用［13-16］，但地高辛標記的Southern雜交還較為困難，主要表現在條帶模糊，背景較深，試驗結果讀取不夠準確等［17-20］。本研究主要以轉基因橡膠樹PCR檢測陽性的植株為材料，結合大量的試驗經驗，從基因組DNA的提取，探針標記的方法以及雜交過程中的細節對橡膠樹地高辛標記的Southern雜交方法進行優化，旨在為轉基因橡膠樹Southern雜交鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

轉啟動子陷阱載體的轉基因植株1株［21］，命名為啟T13，轉HbFCA啟動子的轉基因植株3株［22］，分別命名為S啟j10、S啟j12和S啟j13，上述4株轉基因植株骨架載體均為pCAMBIA2301；轉pCAMBIA2301空載體的轉基因植株2株，命名為PT55和PTj71，均由本課題組利用次生體胚發生方法獲得，以上植株均由GUS和PCR檢測為陽性，對照植株為非轉基因植株。

1.2 方法

1.2.1 目的基因Npt擴增及序列分析 以pCAMBIA-2301載體質粒為模板，利用引物Npt-f/r PCR擴增453 bp的目的基因Npt片段［23］，PCR反應體系及程序參照PrimeSTAR?Max DNA聚合酶（TaKaRa Cat. #DR045A）說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，并切膠回收，取部分回收產物加尾，溶液回收后連接至pMD?19-T載體（TaKaRa Cat. #D102A）上，挑取3個單克隆交由北京華大基因有限公司測序。

1.2.2 地高辛探針標記 分別采用隨機引物法和PCR法對目的基因Npt進行標記。隨機引物法和PCR法探針標記的具體過程分別參考地高辛標記試劑盒II（Roche Cat. #REF 11 585 614 910）及PCR法DIG探針合成試劑盒（Roche Cat. #REF 11 636 090 910）說明書，其中隨機引物法和PCR法的模板均為測序正確的Npt回收產物，濃度分別是1 μg和50 ng。取2 μL PCR標記產物1%瓊脂糖檢測探針標記效率及產量。

1.2.3 探針標記效率的檢測 將上述兩種方法標記的探針以及地高辛標記試劑盒II中的陽性對照DNA稀釋100倍后作為起始濃度按照試劑盒說明書進行系列梯度稀釋，各取1 μL點在帶正電的尼龍膜上，紫外交聯（1200J），按照說明書的方法進行標記效率的檢測，并比較對照與DIG標記DNA稀釋樣品的顯色強度，根據稀釋倍數換算出探針濃度。

1.2.4 橡膠樹葉片基因組DNA的提取 DNA提取的過程詳見DNA提取試劑盒（TIANGEN Cat. #DP320）說明書，盡量選用的材料是轉基因橡膠樹淡綠期葉片，每個樣品抽提10管DNA，用100 μL的滅菌蒸餾水加入到第一管DNA的吸附柱內洗脫，將洗脫液重新加回到原來的吸附柱內再次洗脫，而后用這100 μL的洗脫液重復上述步驟洗脫第2管，直至利用這100 μL洗脫完這10管DNA。取1 μL電泳檢測提取DNA的質量，確保無明顯的蛋白質和RNA殘留后，分光光度計測濃度。

1.2.5 樣品酶切及電泳 每個樣品取40-60 μg進行酶切，酶切體系為300 μL，其中包含30 μL 10×NEB Buffer 2，8-10 μL的限制性內切酶Hind III（NEB）。37℃酶切12-16 h。酶切結束后，取5 μL檢測酶切是否徹底，之后無水乙醇沉淀DNA，加入loading buffer后上樣，待溴酚藍跑至凝膠底端后停止電泳。

1.2.6 真空轉膜及固定 瓊脂糖凝膠的變性與中和參考地高辛標記試劑盒II說明書。使用真空轉移儀進行轉膜，將轉好的尼龍膜放在2×SSC浸泡2 min左右，浸洗2次后將膜洗至中性，并去除膜上的凝膠碎片和雜質，紫外交聯（1200J）固定。

1.2.7 雜交及顯影 雜交及顯影過程參照說明書，略有改動。雜交液42℃預熱，將膜放置在雜交管中，預雜交2 h。取適量探針加入到100 μL雜交液中，PCR儀99℃變性10 min后立即放置冰上，將42℃預熱的雜交液10 mL倒入雜交管中，加入變性好的探針，輕輕混勻，50℃（按照試劑盒說明書的方法計算Mpt基因雜交溫度為48℃-53℃，取中間溫度50℃作為Npt基因的雜交溫度）中速轉動雜交16 h。膜洗滌時，0.5×SSC，0.1% SDS（預熱到68℃）中68℃振蕩洗膜2×20 min。封閉溶液工作液和抗體溶液工作液孵育時間延長至40 min，其余過程與說明書相同。依次進行顯影（一般1 min左右）、水漂洗（10 s）、定影（30 s），定影結束后，用流動的清水沖洗膠片兩面，晾干，照相留存。

1.2.8 探針洗脫及再次雜交 探針的洗脫及再次雜交參照說明書在雜交爐中進行。本研究中先用隨機引物標記的探針進行第一次雜交，剝離后，用PCR標記的探針進行再次雜交。

2 結果

2.1 地高辛標記探針的檢測

2.1.1 常規PCR檢測 PCR標記探針電泳檢測結果如圖1所示，未標記的Npt基因片段大小為453 bp，而PCR法標記上地高辛后，由于DIG的分子量較大，高效率摻入DNA后，探針的分子量明顯增大，電泳檢測時導致遷移速率比沒有摻雜DIG的對照慢，分子量大小在700 bp左右，表明探針標記成功。

2.1.2 地高辛標記探針效率的檢測 檢測結果如圖2所示，對照DNA出現4個稀釋的探針點，而隨機引物法和PCR標記法6個稀釋的探針點均能較好地顯現。經亮度比對并根據稀釋濃度換算發現，隨機引物法標記的探針濃度為3 pg/μL×10×100×100= 300 ng/μL，PCR標記的探針濃度是3 pg/μL×10× 3.3×100×100=990 ng/μL，根據地高辛雜交試劑盒要求探針濃度為25 ng/mL，因此隨機引物法標記的探針加入量為0.85 μL/10 mL，而PCR標記法標記的探針加入量為0.30 μL/10 mL。

2.2 橡膠樹基因組DNA的質量檢測

Southern雜交要求提取具有較高質量的DNA，本研究利用試劑盒提取橡膠樹DNA，電泳結果如圖3所示，DNA條帶主帶明顯，并無拖尾現象，點樣孔處無明顯殘留。紫外分光光度計檢測樣品的OD值，待測樣品的OD260/OD280均在1.8-1.9之間，說明樣品中蛋白含量、RNA含量均較少，而OD260/OD230均大于2.0，說明樣品中無機鹽小分子雜質較少。本研究中利用DNA提取試劑盒提取的DNA純度高，適用于Southern雜交所需DNA的要求（表1）。

2.3 橡膠樹Southern雜交酶切及轉膜

本研究曾用10 μg/80 μL和30 μg/300 μL左右的DNA進行酶切，但是Southern雜交效果不理想，帶型很弱，甚至無法分辨拷貝數（結果未列出）。本試驗中利用至少40 μg的DNA量，在300 μL的酶切體系中Hind III酶切過夜，取5 μL酶切過夜后的產物檢測如圖4-A，結果顯示酶切產物高分子質量區較亮，低分子質量區較暗，酶切效果較好。將剩余的酶切產物回收后點樣，低電壓跑過夜，完全符合Southern雜交的酶切要求，2-3樣品亮度有些偏暗，考慮可能是DNA模板較少，為40 μg，酶切效果較好，而5-8樣品模板為60 μg，亮度均一一致，與未酶切DNA相比可見酶切徹底，酶切效果好（圖4-B）。利用真空轉移儀將DNA轉移至尼龍膜上，并將轉移后的膠放在成像系統中，觀察DNA的轉移情況，一般1-1.5 h可以將膠上的DNA完全轉移至尼龍膜上。

2.4 Southern雜交檢測結果

將尼龍膜固定后進行地高辛雜交，兩種探針標記方法的雜交結果中對照DNA酶切與未酶切的樣品均無雜交帶，隨機引物法的雜交背景較深，雜交條帶不清晰，探針中的雜質影響最終的結果，表現為黑色背景，雜交效率較低，部分單株的拷貝數無法識別（圖5-A）；而PCR標記法的雜交背景較淺，雜交條帶清晰，易分辨，整個結果（圖5-B）中無明顯的黑色背景，符合預期結果。

3 討論

3.1 不同方法探針標記比較

用于Southern雜交探針標記的方法有很多種，常用的有隨機引物延伸法、PCR標記法和切刻平移法。隨機引物法標記探針需要大量的DNA，制備耗時較長，且探針需要純化，否則會造成雜交背景過深，影響對試驗結果的分析研究［11，24］。如本研究采用隨機引物法標記的探針未進行純化，雜交背景較深，且有些單株產生顏色較淺且模糊帶型，雜交結果不易明確讀取。切刻平移法只適用于雙鏈DNA的標記，對于小片段DNA標記效果不理想［25］。PCR標記方法較其他標記方法而言，操作簡便、特異、高效且靈敏度高［26］。PCR標記的探針對模板DNA的質量要求較低，僅需2-10 ng純度適中的DNA模板即可標記［27］。該方法采用專一的標記酶，價格相對昂貴［6，25］，但單次雜交所需的探針量很少。一次標記可產生50 μL的PCR產物，本研究中單次雜交探針的使用量在0.3 μL/10 mL左右，一次標記可使用150次，不同的探針標記可以按照比例縮小PCR標記的產物量，在一定程度上大大削減雜交成本。PCR法標記的探針靈敏度高于隨機引物法，兩者相差高達一個數量級甚至更多［24，27，28］，本研究中兩者標記的效率相差僅3倍，考慮可能是本研究中隨機引物標記探針的起始DNA模板濃度較高，在相同時間內標記的探針產物也較多。本研究室前期一直利用隨機引物法對目的基因探針進行標記，存在雜交條帶模糊，背景較深，甚至非地高辛標記Marker也可雜交出條帶等問題；本試驗中利用PCR法標記的探針均未出現上述問題，在一定程度上說明PCR法標記探針其特異性優于隨機引物法。從本次研究結果分析，筆者認為橡膠樹植株的Southern雜交檢測時，PCR法標記法更有優勢。

3.2 橡膠樹基因組Southern雜交過程中注意事項

3.2.1 DNA的提取方法及酶切 DNA的質量是決定后續Southern雜交順利進行的關鍵，高質量的DNA酶切更為徹底、轉膜更為充分。本研究室前期采用傳統的CTAB法對橡膠樹基因組DNA進行提取［29］，存在DNA中混雜一定量的RNA和其他雜質，導致DNA濃度檢測不夠精準，無法準確計算酶切體系中加入的DNA量，且提取DNA耗時較長，需要約2 d時間。本研究中采用適合富含多糖、多酚類物質的DNA提取試劑盒對橡膠樹基因組DNA進行提取，相較傳統的CTAB提取方法而言，試劑盒提取的DNA濃度雖然較低，但純度大幅提高，紫外分光光度計檢測的濃度更為準確，酶切體系中加入的DNA模板可準確定量。且DNA提取時間僅需2 h。橡膠樹的基因組較大，結構較復雜［12］，同等強度的雜交信號所需的酶切量較大。本研究中高質量DNA樣品的酶切量至少在40 μg以上，利用擴大的酶切體系，酶切充分的樣品DNA產生若干大小不同的片段，呈現連續的，熒光由深至淺的均勻條帶，酶切效果更為理想。酶切產物選用直接加乙醇沉淀［7］，避免酶切產物的損失。

3.2.2 Southern雜交過程中的注意事項 利用地高辛標記的探針進行Southern雜交時，最常見的問題是高背景［30］。本研究中將封閉溶液工作液和抗體溶液工作液孵育時間延長至40 min，非嚴謹性洗膜采用68℃高溫，并延長洗膜時間至20 min×2次。Solanas等［4］認為足夠量的地高辛抗體可以獲得較好的雜交信號，但是過高的抗體濃度可能會產生多斑點的背景，本研究按照地高辛試劑盒的要求加入抗體，雜交效果較好。Southern雜交加入的探針體積通常為幾微升，本研究中將計算加入的探針量預先加入100 μL雜交液中變性，而后將其加入雜交管中，可最大程度減少探針的損失，且可避免高濃度的探針直接黏附在膜上產生黑斑［31］。有文獻報道在堿轉移結束后無需對尼龍膜上的DNA進行專門的固定［32］，考慮到轉移結束后的尼龍膜潮濕不利于保存，且為防止長期保存過程中DNA結合不緊密影響雜交效果，本研究中仍然利用紫外交聯儀進行DNA固定。在轉基因植株的Southern檢測過程中往往需要對同一張膜進行多個探針的雜交，因此探針的剝離尤為重要，在雜交和檢測的過程中始終保持尼龍膜的濕潤；在用NaOH/SDS處理尼龍膜時，在雜交爐中保證溶液與尼龍膜正面充分接觸，并調整雜交爐的轉速為中速，減少膜上DNA的損失［33］。

4 結論

本研究針對基因組DNA的提取、PCR法與隨機引物法標記探針的比較以及雜交過程中的注意事項等方面對基于地高辛標記的橡膠樹Southern雜交技術體系進行了優化。使用DNA提取試劑盒提取的至少40 μg高質量DNA在300 μL的大酶切體系中，酶切12 h可獲得良好的效果。利用PCR法標記探針的效率及雜交結果明顯強于隨機引物法。延長封閉溶液工作液和抗體溶液工作液孵育時間至40 min，非嚴謹洗膜采用68℃，且延長時間至20 min/次，并將探針預先加入到雜交液中進行變性減少探針的損失和避免膜上產生黑斑等方面進行了優化。

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（責任編輯 李楠）

Optimization of Digoxigenin Based Southern Blot for Transgenic Hevea brasiliensis Analysis

Li Ji1Lu Xu1，2Huang Tiandai1Hua Yuwei1Huang Huasun1
（1. Rubber Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences & Key Laboratory of Rubber Biology，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737；2. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）

Southern blot technology based on the DIG-chemiluminescent detection has been widely used in numerous species. Using Hevea brasiliensis as materials, the DIG-labeled Southern blot analysis was improved through optimizing several key steps, including extraction of genome DNA, usage of DNA samples amount, digestion system, the comparison between PCR and random-primed labeled method and a serial of procedure in the process of the hybrid. The results showed that desirable digestion result could be achieved when at least 40 μg DNA samples with high quality were enzymed in 300 μL reaction system for 12 hours. The efficiency of probe labeled with the method of PCR was higher than that of probe labeled with random primer obviously, while the Southern blot result of PCR labeled was clear, and the background was lightly, which was conducive to read the copy number accurately. Finally, Southern blot with DIG-labeled was optimized, and good result with high sensitivity and low background was achieved．

Hevea brasiliensis Transgene Southern blot DIG labeling PCR labeled method

2014-03-28

國家自然科學基金項目（31200503），現代農業產業技術體系建設專項（NYCYTX-34）

李季，男，博士，助理研究員，研究方向：橡膠樹轉基因后代分子檢測及橡膠樹內源啟動子的克隆；E-mail：appleliji@163.com

黃華孫，男，研究員，研究方向：橡膠樹種質創新與遺傳育種；E-mail：xjshhs@163.com