牦牛不同組織TLR3、TLR5mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對定量研究

陳亞冰蘭道亮林寶山黃偲黃勇李鍵，

（1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041）

牦牛不同組織TLR3、TLR5mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對定量研究

陳亞冰1蘭道亮2林寶山1黃偲1黃勇1李鍵1，2

（1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041）

參考牦牛TLRs基因序列設計熒光定量PCR特異性引物，建立檢測牦牛TLRs相對表達量的熒光定量PCR方法，分析TLR3及TLR5基因在牦牛不同器官組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示兩基因具有不同的表達譜及表達量，其中TLR3基因除在乳腺組織外，在其它組織器官中均有轉(zhuǎn)錄，其中在心、大腸、胃和肌肉組織中表達量較高；TLR5基因則在心、肺、大腸、小腸、胃、肌肉、卵巢組織中具有較高的表達量。該試驗結(jié)果表明，TLRs在不同組織器官轉(zhuǎn)錄水平差異較大，可能與其對病原體的識別有關(guān)；同一個基因在不同組織中存在差異性，這可能與基因作用機理相關(guān)。

牦牛 轉(zhuǎn)錄水平 TLRs 相對定量

病原微生物感染宿主后，宿主細胞通過體內(nèi)廣泛表達的病原分子模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）檢測病原相關(guān)分子模式（Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）的存在，激活宿主的天然免疫應答［1］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一種重要的模式識別受體，通過識別病原體相關(guān)分子模式，刺激信號級聯(lián)反應，最終啟動了機體的天然免疫和引起獲得性免疫反應［2-4］。不同TLRs可以識別相應的PAMPs：TLR3識別病毒雙鏈RNA（Double strand RNA，dsRNA）、單鏈RNA病毒的復制中間產(chǎn)物dsRNA以及聚肌甘酸［poly（I：C）］［5，6］，TLR5主要識別微生物鞭毛蛋白［3］，兩種受體在識別微生物感染感染中起著關(guān)鍵作用。近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被用于檢測TLRs在不同物種、不同組織、不同細胞中的表達量［7-10］。然而，采用定量方法研究牦牛體內(nèi)TLRs表達分布還沒有相關(guān)報道［11-14］。

牦牛是世代生活在高原環(huán)境下的特殊物種，其機體早已適應了高原的低氧、嚴寒等惡劣天氣，對牦牛的抗病分子機制進行研究，一方面可以深入理解高原動物特有的免疫機制；另一方面也為牦牛的抗病育種奠定理論基礎。本試驗前期克隆了牦牛TLR3及TLR5基因序列，基因序列分析結(jié)果表明牦牛TLRs基因和其它物種相應基因具有較高的同源性，因此，下一步要重點比較分析TLRs基因在牦牛體內(nèi)表達模式。本研究基于SYBR Green I RT-CR技術(shù)，檢測并分析TLR3、TLR5基因在不同組織中的表達水平，為后續(xù)研究牦牛體內(nèi)的相關(guān)免疫機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 5頭牦牛（母，平均年齡4歲）來自甘南藏族自治州夏河縣安，均屬于麥洼牦牛。采集11種組織樣本（心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢和乳腺）均放入液氮中送回實驗室保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀及普通PCR儀均是Bio-Rad公司產(chǎn)品；Trizol購自Invitrogen公司；RT反轉(zhuǎn)錄酶及SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取及DNA膠回收試劑盒購于Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)實驗室前期獲得的牦牛TLR3及TLR5全長序列，依據(jù)定量引物設計原則，設計定量引物，普通PCR檢驗引物特異性，引物序列與預期擴增片段長度如表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 組織RNA提取 稱量約200 mg組織樣品后迅速轉(zhuǎn)移至液氮預冷的研缽中，研杵研磨組織，直至研磨成粉末狀。加入1 mL的Trizol，室溫靜置直至樣品完全融化，吸取1 mL至無RNA酶的離心管中，加入200 μL的氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心15 min；小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min；12 000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀加入1 mL 75%的乙醇洗滌，12 000 r/min離心5 min；棄上清，室溫干燥沉淀，加入30 μL DEPC水溶解RNA，檢測RNA的純度及完整性。

1.2.3 cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成 RNA需要進行去除基因組的處理：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA 1 μL，RNA 2 μg，Rnase Free dH2O補 足 到10 μL，42℃ 2 min 進行DNA去除試驗并得到反應液1。采用20 μL體系進行反轉(zhuǎn)錄反應：反應液1 10 μL，PrimeScript RT Enzyme MixI 1.0 μL，Primer Mix 1.0 μL，5× PrimeScript Buffer2 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL。按以下程序進行反轉(zhuǎn)錄反應：37℃、15 min；85℃、5 s，生成的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4TLR3、TLR5基因熒光定量PCR檢測方法及組織表達譜建立

1.2.4.1 引物特異性鑒定 選取牦牛脾臟組織cDNA為模板首先進行普通PCR反應來檢驗引物的特異性，選擇特異性較好的引物進行熒光定量PCR反應，根據(jù)溶解曲線的單一性選擇最近定量引物。

1.2.4.2 熒光定量PCR反應條件優(yōu)化 熒光定量PCR的循環(huán)條件進行了兩步法和三步法的摸索；退火溫度從55℃依次遞增至65℃，每次遞增1℃，確定最佳退貨溫度；最終確定采用三步法進行定量反應，TLR3最佳退火溫度是58℃，TLR5及β-actin最佳退火溫度是60℃。Real-time PCR反應體系為15 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，dH2O 5.5 μL。PCR擴增程序如下：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，39個循環(huán)，添加熔解曲線；每個組織樣品添加3個重復，試驗同時添加一個以dH2O為模板的陰性對照。

1.2.4.3TLR3、TLR5及β-actin基因標準曲線建立 提取陽性菌液質(zhì)粒，將獲得的質(zhì)粒進行濃度測定，用EASY dilution進行10倍倍比稀釋，置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ赃B續(xù)10倍倍比稀釋（1×101-1010copies/μL）的陽性質(zhì)粒標準品為模板進行定量PCR反應，并制作各基因的標準曲線。

1.2.4.4 定量PCR檢測TLR3、TLR5基因在各組織中的表達分布 分別以5頭母牦牛11種組織cDNA為模板，進行定量PCR反應檢測目的基因的表達量，采用Pfaffl method計算出基因在各組織的相對表達量，同時應用SPSS 18.0軟件計算重復樣品之間Ct均值以及標準偏差，最后使用excel制圖功能繪制出基因在牦牛各組織中的相對表達柱狀圖。

Etarget：目的基因擴增效率；Ereference：內(nèi)參基因擴增效率；control：對照組；experiment：試驗組。

2 結(jié)果

2.1 RNA完整性檢測

提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，可明顯地看到28S、18S及5.5S rRNA 3條帶，說明提取的 RNA無降解，可用于反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)定量試驗。

2.2 引物特異性檢驗

以牦牛脾臟組織cDNA為模板、TLR3-S、TLR3-A、TLR5-S、TLR5-A、Actin-S、Actin-A為引物進行熒光定量PCR反應。基因的熔解曲線見圖2，從圖2可以看出，Actin基因在Tm=（82±0.5）℃、TLR3在溶解溫度為Tm=（83.5±0.5）℃，TLR5在溶解溫度Tm=（85±0.5）℃時出現(xiàn)單一的特異性峰，表明該引物特異性良好。菌液測序結(jié)果正確，證明擴增片段是目的片段。

2.3 基因標準曲線建立

對兩基因陽性標準品做10倍梯度稀釋（1×101-1010copies/μL），作為標準曲線制備的模板，按照各基因不同稀釋度的Ct值，選擇最佳檢測范圍，制作標準曲線（圖3）。從圖3可以看出，質(zhì)粒濃度為1×102-108copies/μL時，TLR3基因擴增效率達到了95%，相關(guān)系數(shù)為0.999；質(zhì)粒濃度為1×101-108copies/μL時，TLR5基因擴增效率達到了94.3%，相關(guān)系數(shù)為0.999；質(zhì)粒濃度范圍為1×102-108copies/μL時，β-actin基因擴增效率達到了95.4%，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.4 熒光定量PCR檢測TLR3、TLR5基因在牦牛組

織中的表達分布

以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用Pfaffl method，以小腸基因表達量作為對照組，分析TLR3、TLR5基因在牦牛不同組織中的表達量水平。其中TLR3在心臟，大腸，胃，肌肉及卵巢等組織表達量較高（圖4）；TLR5在心，肺，大腸，小腸，胃，肌肉，卵巢，肌肉，乳腺等組織表達量較高（圖5）。

3 討論

目前，常用的定量PCR檢測方法有Taqman熒光探針方法和SYBR Green I染料方法，其中SYBR Green I熒光嵌合染料因具有無需設計、標記熒光探針和操作簡便、成本低等優(yōu)點，深受研究者們青睞［15］。本試驗中，擴增產(chǎn)物熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)特異性較好的單峰，測序結(jié)果證實為相應的目的片段，表明引物特異性良好。本試驗采用相對定量法，利用β-actin來校準目的基因的表達量，β-actin和目的基因定量具有相似的擴增效率，均在95%左右，符合后續(xù)試驗要求。

TLRs作為一種重要的模式識別受體，不僅在天然免疫中起重要作用，同時也是天然免疫和獲得性免疫的連接點，其可以介導獲得性免疫應答［16］。TLRs的研究為闡明天然免疫機制及尋找由于免疫失調(diào)所致疾病的治療提供新的思路［17］。牦牛是青藏高原上的一個特有物種，其機體可能存在特殊的抗病免疫機制，因此對其免疫機制研究就具有一定的必要性。本實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)牦牛TLR3、TLR5基因與其它平原哺乳動物相應基因具有較高的同源性。因此，分析比較它們的組織表達模式差異可以為理解牦牛機體免疫機制提供了新的思路。TLR3是識別dsRNA的特異性受體，當病毒感染機體時，會在機體的細胞內(nèi)復制產(chǎn)生dsRNA，TLR3可以識別dsRNA，并將信號向下游傳遞，啟動和調(diào)節(jié)機體的天然免疫反應，并繼而激發(fā)獲得性免疫反應［5，6］。本試驗發(fā)現(xiàn)TLR3表達具有一定的組織特異性，其中在心臟、大腸、胃、肌肉及卵巢等組織表達量較高，這可能與局部組織對病原體的識別和抵抗能力有關(guān)。TLR5基因通過識別、結(jié)合入侵病原菌的鞭毛蛋白，激活特定的信號轉(zhuǎn)導通路，誘發(fā)合成細胞因子，啟動機體的天然免疫反應，并誘發(fā)獲得性免疫反應［4］。本試驗利用實時熒光定量PCR技術(shù)對牦牛器官及組織進行TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行研究，為進一步TLRs免疫機制奠定了理論基礎。當然，僅檢測TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄水平不能完全代表Toll樣受體蛋白的表達水平，TLRs在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平差異是否影響到蛋白質(zhì)的表達水平，從而影響下游與配體的結(jié)合能力、下游信號轉(zhuǎn)導及細胞因子的釋放，有待下一步的研究。下一步同時將重點針對不同品種、不同海拔以及不同年齡段牦牛體內(nèi)組織器官轉(zhuǎn)錄水平進行比較。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)TLR5具有一個分布廣泛組織表達譜，同時在心、肺、大腸、小腸、胃、肌肉、卵巢及乳腺等組織表達量較高，這可能與病原體侵入機體途徑多樣化相關(guān)。

［1］ Janeway JCA, Medzhitov R. Innate immune recognition［J］. Annu Rev Immunol, 2002, 20：197-216.

［2］ Kwon S, Vandenplas M, Figucircdo MD, et al. Differential induction of Toll-like receptor gene expression in equine monocytes activaatd by Toll-like receptor ligands or TNF-a［J］.Vet immunol immunopatho, 2010, 138（3）：213-217.

［3］Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors［J］. Annu Rev Immunol, 2003, 21：335-346.

［4］Kopp E, Medzhitov R. Recognition of microbial infection by Toll-like receptors［J］. Curr Opin Immunol, 2003, 15（4）：396-401.

［5］Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, et al. Recognition of doublestranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3［J］. Nature, 2001, 413（6857）：732-738.

［6］Matsumoto M, Kikkawa S, Kohase M, et al. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 293（5）：1364-1369.

［7］ Zarember KA, Godowski PJ. Tissue expression of human Tolllike receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines［J］. Journal of Immunology, 2002, 168（2）：554-561.

［8］ Pruett SB, Zheng Q, Fan R, et al. Acute exposure to ethanol affects Toll-like receptor signaling and subsequent response：an overview of recent studies［J］. Alcohol, 2004, 33（3）：235-239.

［9］ Chang JS, Russell GC, Jann O, et al. Molecular cloning and characterization of Toll-like recetors1-10 in sheep［J］. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2009, 127（1-2）：94-105.

［10］ Tirumurgaan KJ, Dhanasekaran S, Raj GD, et al. Differential expression of Toll-like receptor mRNA in selected tissues goat（Carpra hircus）［J］. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2010, 133（2-4）：296-301.

［11］ 周作勇, 聶奎, 宋振輝, 等. 雛雞不同組織TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR15 mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對定量研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報, 2010, 41（11）：1453-1459.

［12］ 趙一萍, 白東義, 李蓓, 等. 馬Toll樣受體表達水平SYBR Green I 熒光定量RT-PCR檢測方法建立［J］. 畜牧獸醫(yī)學報, 2013, 44（2）：220-229.

［13］ 韓猛立, 黃新, 何延華, 等. 牛Toll樣受體實時熒光定量PCR檢測方法的建立［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2011, 19（3）：521-529.

［14］ 趙一萍, 黃金龍, 白東義, 等. 蒙古馬不同組織器官TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的研究［J］. 中國獸醫(yī)學報, 2012, 32（10）：1542-1546.

［15］ Wong ML, Medrand JF. Rea-time PCR for mRNA quantitation［J］. Biotechniques, 2005, 39（1）：75-85.

［16］ 李根亮, 穆淑梅, 李彥芹, 等. TLR—天然免疫中的特異性受體［J］. 生命化學, 2006, 26（6）：495-497.

［17］ 吳運譜, 喬傳玲. Toll受體研究進展［J］. 動物醫(yī)學進展, 2007, 28（6）：89-92.

（責任編輯 李楠）

Relative Quantification of mRNA Transcription of TLR3 and TLR5 in Different Tissues of Yak

Chen Yabing1Lan Daoliang2Lin Baoshan1Huang Cai1Huang Yong1Li Jian1，2
（1. College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041；2. College of Tibetan Plateau Research，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

According to the sequences of yak TLR3 and TLR5, the real-time PCR primers were designed to establish a method for the detection of mRNA transcription of TLRs by Real-time quantitative PCR, and the transcription level of TLRs in different tissues of yak was analyzed. The results showed that two genes have different expression pattern and expression level in tissues. The TLR3 mRNA was detected in examined tissues except mammary gland, and it was expressed at a higher level in heart, large intestine, stomach and muscle. The TLR5 mRNA level was higher in heart, lung, large intestine, small intestine, stomach, muscle and ovary. The results indicated that there exists difference in the transcription level of TLRs in tissues, which may be associated with the recognition of pathogens. For the same gene, the mechanism of gene may bring difference in expression level in different tissues.

Yak Transcriptional level TLRs Relative quantification

2014-03-15

中央高校青年教師基金項目（2014NZYQN37）

陳亞冰，男，碩士研究生，研究方向：高原動物免疫分子機制；E-mail：cybxc923410296@126.com

李鍵，男，博士，教授，研究方向：動物生殖調(diào)控；E-mail：lijian@swun.cn；蘭道亮，男，博士，副教授，研究方向：動物免疫機理；E-mail：landaoliang@163.com