蘭州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息學分析

金方園徐紅偉達小強臧榮鑫柏家林曹忻蔡勇馮玉蘭楊具田

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030；2. 西北民族大學實驗中心，蘭州 730030）

蘭州大尾羊MAPK13基因cDNA克隆及生物信息學分析

金方園1徐紅偉2達小強1臧榮鑫1柏家林1曹忻2蔡勇2馮玉蘭1楊具田2

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030；2. 西北民族大學實驗中心，蘭州 730030）

克隆蘭州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶MAPK13基因，并分析其序列及其編碼蛋白的生物學特性，為研究綿羊MAPK13基因的功能和生產應用提供參考。根據綿羊MAPK13基因CDS序列設計特異引物，利用RACE和RT-PCR技術克隆獲得蘭州大尾羊MAPK13基因全長序列，并結合生物信息學方法分析其生物學特性。克隆獲得蘭州大尾羊MAPK13基因cDNA 序列全長1 397 bp，其CDS區片段長1 102 bp，編碼367個氨基酸。預測蘭州大尾羊MAPK13蛋白分子量為42.29 kD，理論等電點為8.82，為非跨膜的疏水性蛋白，亞細胞定位主要在細胞質中，無信號肽，不屬于分泌蛋白。預測其氨基酸序列有19個磷酸化位點，3個糖基化位點，3個磷酸化功能結構域，4個其他結構域，1個LCR片段，二級結構以α-螺旋為主。同源性分析顯示蘭州大尾羊MAPK13基因序列與已發布的綿羊MAPK13 mRNA序列（登錄號：NM_001139455.1）相比，其第852位發生堿基轉換（C?A），導致編碼蛋白第265位氨基酸發生堿基轉換（S?T），同時，第951位發生堿基轉換（T?G），但其所編碼氨基酸不變。構建的基因進化樹分析結果顯示蘭州大尾羊與牛親緣關系最近。蘭州大尾羊與其他物種MAPK13基因在結構上相似性較高，說明該基因具有高度的保守性，其序列包含的S_TKc結構域可將ATP的γ磷酰基轉移到蛋白質絲氨酸/蘇氨酸殘基上，導致一系列肥胖相關基因的功能失調和表達變化，為進一步研究MAPK13基因與成脂分化過程的相關性提供了參考。

蘭州大尾羊 MAPK13基因 cDNA 末端快速擴增 生物信息學

促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）鏈是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一［1］。MAPK通路主要包括ERK、p38MARK和JNK三條途徑，主要作用于脂肪細胞組織中，其逐級磷酸化過程［2］涉及成脂分化的調控，與胰島素抵抗、脂肪細胞分化密切相關［3］。p38 delta MAPK也稱為MAPK13，是脂肪細胞分化的主要候選基因。蘭州大尾羊（Lanzhou fat-tailed sheep）是清朝同治年間（1 862-1 875年）由陜西大荔一帶引進的同羊與蘭州當地蒙古羊雜交選育而成的地方綿羊品種，因其尾部脂肪過度沉積，導致尾大、脂肪充實而得名［4，5］。綿羊MAPK13基因克隆及其相關功能研究報道較少。1997年，Cohern等［6］用Ser/Thr磷酸酶處理使MAPKK失活，提出了存在MAPKK激酶的假說。Emanuelli［7］研究證實，胰島素抵抗，二型糖尿病和肥胖均與MAPK有關。2005年，Bost等［8］研究發現，ERK小鼠脂肪細胞含量少于野生型小鼠，與對照組相比，高脂飼料喂養的ERK小鼠有較高的餐后代謝率，不易患胰島素抵抗和肥胖。2009年，趙芳等［3］研究表明，ERK1/2，JNK和p38MAPK三條MAPK信號通路通過獨立作用及復雜的協調作用，參與調控脂肪細胞分化過程的各個環節，其調節作用具有多樣性。2013年，呂雯［9］脂肪細胞等研究表明，ERK和p38MAPKK兩種MAPK信號通路對脂分化的調節在不同的試驗模型中表現為正調控和負調控兩種不同形式；而另一成員JNK能使胰島素受體底物1的絲氨酸發生磷酸化，進而干擾胰島素信號，從而抑制骨髓間充質干細胞（BMSCs）的成脂分化，即對脂肪細胞分化發揮負調控作用。關于MAPK通路對脂肪細胞分化發揮正調控作用，Haridas Nidhina［10］研究表明，香草精通過激活ERK通路，上調了前體脂肪細胞中PPARg的表達，增加了細胞葡萄糖的攝取量，促進了成脂分化。關于MAPK通路對脂肪細胞分化發揮負調控作用，Chuang［11］研究表明，ERF信號通路可以誘導白細胞介素表達，使其下游PPARg被磷酸化，導致PPARg下游生脂相關的靶基因表達水平降低，從而抑制了脂肪細胞分化。此外，Bordicchia等［12-15］的研究，也表明MAPK基因與脂肪代謝關系密切?；蛘{控是細胞分化的核心問題。目前，雖然有關MAPK13基因的研究在報道中較多，但蘭州大尾羊是具有耐粗飼、抗病能力強、飼料利用率高、適應性強、肉質鮮美等優良地方綿羊品種，其尾部脂肪細胞分化與其它綿羊差異顯著。迄今為止，MAPK13等脂肪細胞分化基因克隆及表達的相關報道較少［16］。脂肪細胞分化過程與脂肪細胞特異性功能基因的表達調控密切相關，涉及多種脂肪特異性轉錄因子的激活。本研究以蘭州大尾羊為研究對象，應用RT-PCR技術獲得cDNA，利用RACE法對MAPK13基因進行克隆和序列分析，為進一步研究MAPK13基因對蘭州大尾羊尾部脂肪細胞分化的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 2012年3月于永登明鑫良種肉羊繁育場選購6月齡蘭州大尾羊（羯羊），頸靜脈放血后，快速切取尾部脂肪組織，切成小塊，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存備用。蘭州大尾羊脂尾肥大，方圓平展，自然下垂飛節上下，尾有中溝將尾部分為左右對稱兩瓣，尾尖外翻，并緊貼中溝，尾面著生被毛，內面光滑無毛，呈淡紅色。由于該品種瀕臨滅絕，純種存欄不足百只，利用正常繁育羊只開展研究工作受到了限制，因而屠宰了1只羯羊進行了研究。該羊尾脂重1.71 kg，占體重的3%，具有理想羊只的特征。以下實驗于西北民族大學實驗中心進行。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus（TaKaRa）、SMART-erTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）、DH5α感受態細胞（TaKaRa）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、質粒小提試劑盒、X-gal、IPTG、DNA Marker，6×loading buffer、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、氯仿、異丙醇、0.1%DEPC、75%乙醇、RNase-free水、5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、氯化鈉等均購自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪組織總RNA的提取 通過TRIzol法提取總 RNA。

1.2.2 引物設計與合成 根據綿羊MAPK13mRNA序列（登錄號：NM_001139455.1），按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit要求［17］，利用Primer 5.0軟件設計引物，由上海生工合成。公司測序。

1.2.5 數據分析 利用DNASTAR軟件對已獲得的MAPK13序列片段進行拼接，對拼接的cDNA序列進行分析并推導其氨基酸序列；利用ProtParam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.htmL）分析氨基酸序列的理化性［18］；利用IBCP（http：//npsa-pbil. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預測蛋白質的二級結構［19］；利用PHYRE2（http：// www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預測蛋白質的三級結構［20］；利用 TMHMM（http：// genome.cbs.dtu.dk/services /TMHMM/）分析蛋白質的跨膜結構［21］；利用Protscale（http：//web.expasy. org/protscale/）分析蛋白質親疏水性；利用NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質磷酸化位點；利用NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu. dk/services/NetNGlyc/）分析蛋白質糖基化位點；利用 TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析蛋白潛在信號肽；利用SignalP4.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白分泌途徑；利用 PSORT II Prediction（http：//psort.hgc.jp/form.html）預測蛋白質的亞細胞定位；利用 Smart（http：//smart. embl-heidelberg.de/）分析預測氨基酸序列的保守結構域；利用Blast和DNAman軟件分析其同源性及構建系統發育樹［22］。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 cDNA 第一條鏈的合成根據SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進行操作。

1.2.4 RACE反應及產物回收 根據SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit中 3'-Full RACE Core Set 和 5'-Full RACE Core Set 2 5'-full race試劑盒進行蘭州大尾羊MAPK13的 3'端與 5'端序列的擴增，具體操作步驟參考產品說明書，用CDS區引物CDS1和 CDS2按常規方法進行 RT-PCR 擴增。反應結束后各取 3'-RACE PCR 產物、5'-RACE PCR 產物和CDS區PCR 產物5.0 μL，用 12 g/L瓊脂糖凝膠電泳。目標3'-RACE cDNA、5'-RACE cDNA和CDS區PCR產物經DNA凝膠回收試劑盒進行回收和純化，連接至pDM19-T載體，提取質粒并送上海生工生物工程

2 結果

2.1 蘭州大尾羊MAPK13基因cDNA末端快速擴增（RACE）

根據SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒中5'-full race試劑盒和3'-full race試劑盒說明書進行的操作步驟。NGSP1擴增得到90 bp 5'-RACE cDNA，NGSP2擴增得到741 bp 3'-RACE cDNA；CDS區引物CDS1和CDS2擴增獲得1 102 bp中間片段（圖1）。

2.2 蘭州大尾羊MAPK13基因cDNA 序列分析

將中間片段、5'-RACE 和 3'-RACE序列測序拼接后獲得蘭州大尾羊MAPK13基因1 397 bp的全長cDNA序列。MAPK13基因核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列如圖2所示，蘭州大尾羊MAPK13基因的開放閱讀框為1 101 bp，起始密碼子為ATG位于58 nt，終止密碼子為TAG位于1 158 nt，編碼367個氨基酸。編碼區兩側翼分別具有5'-UTR 57 bp（1-57 nt）和3'-UTR 214 bp（1 158-1 397 nt）。其中C+G%=57.55%，分子量42.29 kD。

2.3 蘭州大尾羊MAPK13蛋白質結構分析

2.3.1 基因蛋白理化性質分析 DNAstar軟件分析表明，蘭州大尾羊MAPK13基因cDNA編碼蛋白質367個氨基酸殘基中，有52個堿性氨基酸（K，R），占氨基酸總數的14.2%；47個酸性氨基酸（D，E），占氨基酸總數的12.8%；124個疏水氨基酸（A，I，F，W，V），占氨基酸總數的33.8%；87個極性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y），占氨基酸總數的23.7%。

2.3.2 基因蛋白二級結構與三級結構預測 ProtParam程序分析表明蘭州大尾羊MAPK13蛋白的的分子量為分子量42.29 kD，理論等電點為8.82。蘭州大尾羊MAPK13蛋白中，α-螺旋（Alpha helix）占41.26%；隨機卷曲（Random coil）占39.89%；延伸鏈（Extended strand）占18.85%（圖2）。通過PHYRE2預測其三級結構（圖3）。

2.3.3 MAPK13蛋白的保守結構域 根據 Smart軟件推測，MAPK13蛋白質其第306-319個氨基酸殘疾有一段LCR序列（表2，圖4）。

2.3.4 蛋白基因跨膜結構與親疏水性分析 TMHMM分析也表明蘭州大尾羊MAPK13蛋白無跨膜螺旋，為非跨膜蛋白。利用ExPASy的Protscale分析蛋白疏水性（圖5）發現，該基因編碼蛋白疏水性最大值為2.078，最小值為-3.044。該氨基酸序列內絕大多數為疏水性殘基，表明綿羊MAPK13基因編碼蛋白為不溶性蛋白。

2.3.5 亞細胞定位 根據TargetP 和SignalP 軟件預測，推測該蛋白無信號肽，不是分泌蛋白，大部分在游離核糖體上合成（表3）。將MAPK13蛋白序列輸入 PSORT II Prediction，可以基本確認該基因蛋白不屬于分泌蛋白，主要在細胞質（45%）和過氧化物酶體（36.5%）中發揮生物學作用，少量作用于溶酶體（10%）和線粒體基質（10%）（表4）。

2.3.6 蛋白基因磷酸化與糖基化位點分析 根據NetPhos 2.0 Server軟件分析，結果（圖6）表明MAPK13蛋白含有12個絲氨酸Ser，3個蘇氨酸Thr，4個酪氨酸Tyr可以成為蛋白質激酶磷酸化的位點。根據NetNGlyc 1.0 Server軟件分析，結果表明其含有3個糖基化位點：N15、N201、N347。

2.4 蘭州大尾羊MAPK13基因及其編碼蛋白與其他動物同源性比較

用Blast進行核苷酸同源性在線分析，結果表明蘭州大尾羊MAPK13基因核苷酸序列與牛、人、海象、犬、猴、虎鯨、海豚和鼠核苷酸序列間的同源性分別為97%、92%、91%、91%、91%、90%、90%和88%，說明蘭州大尾羊與綿羊和牛的親緣關系較近，與鼠類親緣關系最遠。用DNAman軟件進行氨基酸同源性分析，結果（圖7）表明，蘭州大尾羊MAPK13氨基酸序列與牛、猴、犬、海象、海豚、虎鯨、鼠和人核苷酸序列間的同源性分別為99.2%、87.8%、94.8%、93.7%、91.8%、92.1%、92.1%和81.1%，其中與牛同源性較高，與鼠和人類同源性較差。系統發育樹（圖7）也表明，蘭州大尾羊與牛的進化水平更為接近，與人類較遠。蘭州大尾羊MAPK13基因序列與已發布的綿羊MAPK13mRNA序列（登錄號：NM_001139455.1）相比第852位發生堿基轉換（C←→A），導致編碼蛋白第265位氨基酸發生堿基轉換（S←→T），同時，第951位發生堿基轉換（T←→G），但其所編碼氨基酸不變（圖8）。

3 討論

本研究通過RT-PCR和RACE技術首次克隆了蘭州大尾羊MAPK13基因cDNA 全長序列1 397 bp，其CDS區片段長1 102 bp，編碼367個氨基酸。蘭州大尾羊MAPK13基因核苷酸序列與牛、人、海象、犬、猴、虎鯨、海豚和鼠核苷酸序列間的同源性分別為97%、92%、91%、91%、91%、90%、90%和88%。蘭州大尾羊MAPK13基因序列與已發布的綿羊MAPK13mRNA序列（登錄號：NM_001139455.1）相比，其第852位發生堿基轉換（C←→A），導致編碼蛋白第265位氨基酸發生堿基轉換（S←→T），同時，第951位發生堿基轉換（T←→G），但其所編碼氨基酸不變。系統發育樹符合進化規律。由此可見，蘭州大尾羊與各物種MAPK13基因序列間具有高度的保守性，從而預測生物體內由MAPK13基因所指導的生物學功能非常穩定。

預測MAPK13分子量為42.49 kD，為非跨膜的疏水性蛋白，無信號肽，不屬于分泌蛋白。亞細胞定位主要在細胞質（45%）和過氧化物酶體（36.5%）中發揮生物學作用，少量作用于溶酶體（10%）和線粒體基質（10%）。綜上推測MAPK13蛋白大部分在游離核糖體上合成，其功能與過氧化物酶體有關。該預測結果符合其促分裂素原活化蛋白激酶的身份。

MAP級聯反應主要通過絲/蘇/酪氨酸的磷酸化作用推進。S_TKc結構域由十幾個保守半胱氨酸殘基組成，具有絲/蘇氨酸激酶催化功能，經上游MAPK激酶MKK3和MKK6激活，可將ATP的γ磷?；D移到蛋白質絲/蘇氨酸殘基上，是細胞外信號反應的重要介質［24］。其催化核心的N端存在一個LLLL富集區，這個區域可能與ATP的結合有關。TyrKc酪氨酸激酶結構域與S_TKc功能基本相同，包含活性位點、ATP結合位點和底物結合位點，可催化ATP的γ磷酸基團轉移到專一性底物如蛋白絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基基團［24］。MAPK級聯放大過程中存在一個Ras-Raf-MAPKKMAPK信號轉導通路，該通路則需要RasGap結構域的參與，Ras在PTKs介導的信號通路中也是一種關鍵組分。Ras蛋白是ras基因表達產物，具有GTPase活性，分布于質膜胞質一側，結合GTP時為活化狀態，而結合GDP時為失活態，所以Ras蛋白也是GTPase開關蛋白［25］。Yamakawa［26］通過對逆轉錄病毒法處理的小鼠B細胞進行篩選，發現RasGAP結合蛋白Dok-1作為一個酪氨酸磷酸化激活分子作用于其途徑的下游，但其本身并沒有被磷酸化，從而證明Dok-1是連接激活素受體與Smad蛋白的重要分子。Smads家族蛋白可以將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核，因此，RasGAP結構域間接地激活或抑制了靶基因的轉錄［27］。預測MAPK13氨基酸序列有19個可以成為蛋白質激酶磷酸化的位點，某些位點被磷酸化后，可導致一系列肥胖相關基因的功能失調和表達變化，如胰島素增敏激素，脂聯素（adiponectin）的表達減少［28，29］，從而推測其磷酸化反應過程可能與脂肪代謝相關聯。保守結構域預測結果分析表明，蘭州大尾羊MAPK13蛋白序列中含有3個磷酸化功能結構域：S_TKc絲/蘇氨酸激酶結構域、TyrKc酪氨酸激酶結構域和Rio絲氨酸激酶結構域，1個RasGAP信號傳導結構域，1個CPSase_sm谷氨酰胺氨基轉移酶結構域，1個IENR1核酸內切酶結構域，1個MgtE_N Mg2+轉運結構域。說明MAPK13基因可能通過磷酸化調控蘭州大尾羊脂肪代謝和局部沉積，是研究蘭州大尾羊尾部脂肪細胞分化的重要候選基因。

4 結論

應用RACE技術首次克隆了蘭州大尾羊MAPK13基因1 397 bp全長cDNA序列（登錄號：KF770837），并對其核苷酸與編碼氨基酸序列特性進行了研究，為進一步研究綿羊MAPK13基因功能提供參考。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Bioinformatics Analysis of MAPK13 Gene in Lanzhou Fat-tailed Sheep

Jin Fangyuan1Xu Hongwei2Da Xiaoqiang1Zang Rongxin1Bai Jialin1Gao Xin2Cai Yong2Feng Yulan1Yang Jutian2
（1. College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030；2. Science Experimental Center，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030）

The objective of this study is to reveal the biological function of mitogen-activated protein kinases（MAPK）gene in sheep and provide theoretical data for application by cloning MAPK and analyzing its sequence as well as genetic features. The specific primers on the CDS template of MAPK13 gene were designed and then the MAPK13 gene sequence of Lanzhou fat-tail sheep was cloned using RACE and RTPCR technology. After that, its genetic characteristics were analyzed by bioinformatics methods. The 1 397 bp full-length cDNA of MAPK13 of Lanzhou fat-tailed sheep was obtained, in which the length of CDS is 1 102 bp. It encodes 367 amino acids in total. It was predicted that the molecular weight of MAPK13 protein of Lanzhou fat-tail sheep is 42.29 kD and its theoretical isoelectric point is 8.82. It is a non-transmembrane hydrophobin with no signal peptide, which locates mostly in cytoplasm by the result of subcellular level prediction and does not belong to the secretory protein. Its amino acid sequence contains 19 phosphorylation sites, 3 glycosylation sites, 3 phosphorylation domains, 4 other domains and 1 LCR domain. Also, its secondary structure is mainly randomly curly. Nucleotide sequence analysis revealed that the gene nucleotidesequence of Lanzhou fat-tail sheep has some different from the known sheep MAPK13 mRNA（Genbank No.：NM_001139455.1）. Base transition occur in the 852th site is（C vs. A）, respectively, the corresponding amino acids in the 265th is（S vs. T）. Base transition occur in the 951th site is（T vs. G）, but the corresponding amino acids do not change.The phylogenetic tree indicates that Lanzhou fat-tail sheep is close to bos. The fact that the structure of MAPK13 of Lanzhou fat-tail sheep highly similar with other species indicates that the gene is highly conservative. The S_TKc domain in the sequence can transfer the gamma phosphoryl of ATP to the serine / threonine residues of protein, leading to function imbalance and expression change in a series of obesity related gene.

Lanzhou fat-tailed sheep MAPK13 gene RACE Bioinformatics analysis

2014-01-23

國家自然科學基金項目（31160440，31260533，31360529）,甘肅省科技支撐計劃項目（1011NKCA051）,蘭州市科技計劃項目（2011-1-113），西北民族大學研究生科研創新項目（ycx13175）

金方園，E-mail：373995197@qq.com

楊具田，教授，碩士生導師，E-mail：jutianyang988@163.com；臧榮鑫，教授，碩士生導師，E-mail：rongxinzang2000@163.com