杉木炭疽病拮抗菌AM53的發酵條件優化

楊菁 周國英 譚益民 路宗巖

（中南林業科技大學 教育部經濟林培育與保護重點實驗室，長沙 410004）

杉木炭疽病拮抗菌AM53的發酵條件優化

楊菁 周國英 譚益民 路宗巖

（中南林業科技大學 教育部經濟林培育與保護重點實驗室，長沙 410004）

旨在優化地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）AM53的發酵條件。通過Plackett-Burman試驗篩選到影響AM53活菌數的重要因素為培養溫度、初始pH、搖床轉速。經最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗，獲得AM53的最佳發酵條件為培養溫度30.5℃，初始pH8，搖床轉速185 r/min，接種量為5%，培養24 h。結果顯示，在此條件下，OD600平均為1.861，其值與預測值基本相符，說明該模型可信度高，可應用于AM53發酵條件優化。

拮抗菌AM53 發酵條件 Plackett-Burman試驗 Box-Behnken試驗

炭疽菌的分布極為廣泛，且寄主繁多，可侵害多種樹木，尤其是對一些豐產速生林能夠造成嚴重危害［1，2］。杉木炭疽病是杉木栽培區的主要發生病害之一，幾乎有杉木的地區都會有炭疽病發生。病輕時，會導致杉木幼苗的針葉或嫩梢變褐枯萎，嚴重時，常會造成杉木幼林成片的枯黃、枯死，對杉木林造成了毀滅性的損害［3-5］。因此，需要尋找一種高效、安全的防病方法來控制及預防該病在杉木上的擴散。利用生防細菌或其代謝產物來防治植物病害，使寄主植物周圍的有益微生物和有害微生物達到平衡，從而起到防病增產的目的［6］。

發酵培養條件對微生物發酵液中的菌體含量和代謝產物都有較大的影響［7-9］。響應面分析法（Response surface methodology，RSM）可同時對影響響應值的各因子水平及他們的交互作用進行優化和分析，并快速有效地確定多個因子系統的最佳培養條件［10，11］。該方法可以減少試驗步驟，提高準確性。本研究通過對從湖南攸縣杉木根際土壤中篩選得到的杉木炭疽病拮抗細菌地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）AM53進行發酵條件的優化，旨在獲得最佳的拮抗效果，為后續杉木炭疽病微生物制劑的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 指示菌株：杉木炭疽病的病原菌，由本實驗室分離及鑒定，保藏于本實驗室的菌種保藏中心，編號為CSUFTCC F0101。

拮抗菌株：地衣芽孢桿菌AM53，由本實驗室分離、篩選及鑒定，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No. M2012273。

1.1.2 培養基 液體發酵培養基（NB液體培養基）：牛肉膏蛋白胨培養基。

平板培養基：PDA培養基，用于病原菌的活化及抑菌活性的測定。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備、發酵及菌體濃度的測定 菌懸液的制備：將斜面上生長良好的AM53菌株接種到含40 mL培養液的三角瓶中（100 mL），于28℃、160 r/min，振蕩培養24 h后獲得。

基礎發酵條件：按照一定的比例接種種子懸液到含20 mL NB培養液的三角瓶中（100 mL），于一定溫度下振蕩培養24-48 h后制成種子液。

菌體濃度的測定：取AM53菌株發酵液，空白培養液作為對照，在722s可見分光光度計上測600 nm時菌液的 OD（optical density）值，以OD值的大小來表示菌體的濃度［12］。

1.2.2 Plackett-Burman試驗設計 使用Design-expert 8.0 設計一個5因素2水平的Plackett-Burman（PB）試驗，以菌體濃度OD600為響應值，從搖床轉速、初始pH、溫度、接種量和培養時間眾多因素中，在最少的試驗次數情況下，篩選出對菌體產量具有顯著作用的因素。一般情況下，高水平（+）取低水平（-）的1.0-1.5倍［13］。PB試驗各因素及其水平如表1所示。

1.2.3 最陡爬坡試驗 在確定影響菌體濃度的顯著性因素后，設計最陡爬坡試驗，從而進一步確定各因素的變化方向和步長，以逼近最大的菌體產量的極值點。

1.2.4 Box-Behnken試驗 應用Design-expert 8.0 設計的Box-Behnken design（BBD）試驗法，包含了17個試驗點，主要分為兩類：析因點有12個，即為自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點；零點即區域中心點，零點試驗重復5次，用于估計試驗誤差。最后通過對數據的分析，獲得最佳的發酵條件。試驗中各因素水平如表2所示。

2 結果

2.1 Plackett-Burman篩選試驗

對PB試驗結果（表3）進行方差分析，方差分析結果（表4）顯示，對菌體產量影響較為顯著的前3個因素分別為：培養溫度（P=0.018）、初始pH（P=0.076）、搖床轉速（P=0.090）。經過方差分析，獲得多元一次不等式（已編碼）：

OD600=0.92467+0.23033 搖床轉速+0.24367初始pH-0.02900培養時間+0.06667接種量+0.36883培養溫度

在該等式中，培養溫度、初始pH，搖床轉速的系數分別為+0.36883，+0.24367，+0.23033，均為正數，即培養溫度、初始pH和搖床轉速對OD600都呈正效應［14］，因而提高pH和搖床轉速，升高培養溫度能夠增加OD600的值，即增加菌體濃度。根據Plackett-Burman的試驗結果，設計最陡爬坡試驗。

2.2 最陡爬坡試驗

根據對Plackett-Burman試驗結果的分析，設計爬坡試驗，結果（表5）顯示，最優的培養條件為處理3，因此以處理3中各因素的水平為Box-Behnken 試驗的0水平點，設計試驗。

2.3 Box-Behnken試驗

采用Box-Behnken中心設計原理，對影響AM53菌株的活菌數的上述重要因素，即培養溫度（℃）、初始pH和搖床轉速（r/min），采用Design-expert V8.0軟件對其進行3因素3水平的中心組合設計，試驗因素水平設計以及結果見表6。

為考察各因素對AM53菌株活菌數的影響，以菌體發酵液在OD600的吸收值為指標，利用 Designexpert 8.0軟件對表6中的試驗結果進行分析，得到三因素與OD600值（Y）之間的回歸方程：

Y=-36.555+1.519A+1.189B+0.113C+0.011AB+2.688E-5AC-6.900E-4BC-0.0265E-3A2-0.087B2-2.927E-4C2

二次多項式方程擬合的方差分析結果（表7）顯示，本試驗的回歸模型達到了極顯著水平（P＜0.0001），回歸方程的相關系數R2=0.9889，說明該模型回歸顯著，另外，失擬項不顯著（P=0.2518＞0.05，a=0.05），誤差項不顯著，表明實際情況與回歸方程之間吻合度較好，試驗誤差較小，可用此回歸方程代替試驗真實點，對試驗結果進行分析。另外，該回歸模型各項的方差分析結果還表明，一次項和二次項都有較顯著影響，則響應值的變化較為復雜，與各具體試驗因素之間并不是簡單的線性關系。因此在一定范圍內可變動pH、培養溫度和搖床轉速之間的關系，從而使發酵液中的活菌數達到最高水平。

利用 Design-expert 8.0軟件對表6中的試驗結果進行二次多項式回歸擬合，得到二次多項式回歸方程的響應面圖及等高線圖（圖1-圖3）。

Design-expert 8.0軟件對表6中的數據進行分析后，可得到發酵液的最大OD600值為1.864。各試驗因素的最佳取值分別為：培養溫度為30.52℃，初始pH為8.09，搖床轉速為184.67 r/min。為了驗證本次分析結果的準確性，結合實際情況，將菌株AM53發酵培養條件的最佳條件修正為：培養溫度30.5℃，初始pH=8，搖床轉速185 r/min，進行3次重復試驗，所得發酵液的實際OD600值的平均值約為1.861。可見，實際結果與Design-expert 8.0軟件的預測結果符合良好，說明采用響應面法（RSM）優化菌株AM53的發酵培養條件是可行的。

3 討論

杉木炭疽病是潛伏侵染性的病害，針葉帶菌率隨著氣溫的升高而增加，到8月份達到最高。入秋后，溫度適宜時又會有少量的植株感病；11月后逐漸下降，到3月底降到最低，4月份又開始回升，危害嫩葉、嫩梢。目前，已見報道的杉木炭疽病防治方法大多是營林防治和化學防治。其中，化學防治方法是在病害發生的早期，采用波爾多液、可濕性退菌特、多菌靈或炭疽福美等各藥劑交替使用，從而防治杉木炭疽病的發生與擴散。但是，化學藥劑基本上只有預防作用，卻沒有很有效的治療作用［15-17］。同時，化學農藥的使用，也會破壞了自然界的生態平衡。

本研究從杉木葉片中分離得到了杉木炭疽病的拮抗細菌AM53，并鑒定了該菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。在抑菌試驗過程中發現，新鮮的發酵液具有穩定的抑菌效果，這與發酵液中的活菌數、菌活力及代謝產物有著密切的關系，由于拮抗菌AM53的培養基是基礎的細菌牛肉膏蛋白胨液體培養基，因而不再對其進行優化研究，對拮抗細菌AM53的發酵條件展開了優化研究。經過Plackett-Burman篩選試驗表明，培養溫度、初始pH和搖床轉速對AM53活體數有顯著的影響作用，且均為正效應。通過最陡爬坡試驗的結果分析，找到逼近響應值的區域。最后通過對Box-Behnken試驗結果的分析，找到拮抗菌AM53的最佳發酵條件，在該發酵條件下，拮抗菌AM53的平均OD值為1.861。

4 結論

本研究通過對杉木拮抗菌AM53的發酵條件進行優化，優化后培養條件為：培養溫度30.5℃，初始pH=8，搖床轉速185 r/min，接種量為5%，培養24 h。在此條件下，OD600平均值為1.861。經驗證表明該模型能較好的預測該菌株實際發酵產酶的情況，說明該模型可以在實踐中應用。

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（責任編輯 馬鑫）

Optimization of Fermentation Conditions of Antagonistic Bacterium AM53 Against Colletotrichum gloeosporioides

Yang Jing Zhou Guoying Tan Yimin Lu Zongyan
（The Key Laboratory for Economic Forest Cultivation and Conservation of Education Ministry，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）

It was to optimize the fermentation conditions ofBacillus licheniformis.The Plackett-Burman design was used to optimize the fermentation conditions, and the results showed that culture temperature, the initial pH and the rotating speed had significant influence on the count of the living AM53. After the steepest ascent test and Box-Behnken design, the optimal fermentation conditions of AM53 that we got were：culture temperature was 30.5℃, the initial pH was 8, rotating speed was 185 r/min and inoculation volume was 2%, cultured 24 hours. Under this condition, the average of OD600was 1.861, which means the experimental values agreed with the predicted values, the predicted model was reliable and available for the optimization of AM53 fermentation conditions

Antagonistic bacterium AM53 Fermentation conditions Plackett-Burman design Box-Behnken design

2013-12-10

林業公益性行業科研專項（201004014）

楊菁，女，碩士研究生，研究方向：應用微生物；E-mail：123196515@163.com

周國英，女，博士，教授，研究方向：林業微生物；E-mail：gyzhou2118@163.com