斑馬魚模型在藥物早期安全性評價中的應用

劉可春，孫晨，王希敏，侯海榮

（山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250014）

*藥理與毒理專欄*

斑馬魚模型在藥物早期安全性評價中的應用

劉可春，孫晨，王希敏，侯海榮

（山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250014）

在藥物研發領域，建立經濟、有效的藥物早期安全性評價技術已成為當前國內外的迫切需求。斑馬魚作為常用的三大模式動物之一，是一種理想的藥物早期安全性評價模型。采用該模型對新藥進行早期安全性評價可以提高藥物早期毒性預測的可靠性和靈敏度，縮短新藥研發周期，降低新藥研發成本，提高新藥研發成功率。本文綜述了斑馬魚模型在藥物早期安全性評價，如一般毒性評價、發育毒性評價、神經毒性評價、器官毒性評價、生殖毒性評價等中的作用。隨著生物與醫藥技術的發展，斑馬魚在藥物研發的早期安全性評價領域將發揮更大的作用，并推動藥物研發的進程。

斑馬魚；藥物早期安全性評價；毒性評價

在藥物發現與臨床前研究階段，有40%左右的藥物由于毒性和安全性等問題被淘汰；在藥物臨床試驗階段，又有約60%左右的藥物因肝臟、心臟或是神經毒性被終止臨床試驗。1975—2007年間，47種藥物由于具有明顯副作用而退出市場［1］。因此，建立經濟、有效的藥物早期安全性評價技術已成為當前國內外新藥研發領域的迫切需求，“早發現、早淘汰”已成為國內外新藥研發界的新理念。在藥物研發的臨床前實驗階段，通常以細胞作為研究對象，進行體外實驗和藥物安全性評價。該方法雖然具有快速、高效等優點，但是其篩選結果種屬差異性較大，并且不是在機體水平對藥物安全性進行整體評價。所以，在藥物研發過程中，利用相應的動物模型，在機體內部對藥物進行快速、有效的早期安全性評價具有非常重要的意義。

傳統的新藥臨床前體內安全性評價一般采用嚙齒類動物作為實驗對象，該方法雖然具有結果可靠、綜合全面等優點，但是其成本較高，并且不適合于高通量的藥物篩選與毒性機制的研究。因此急需一種既具有細胞實驗的高通量性和經濟性，又具有體內實驗的可靠性和全面性等優勢的模式動物。本文就斑馬魚模型在一般毒性、發育毒性、神經毒性、器官毒性和生殖毒性等評價中的應用進行了綜述，旨在將斑馬魚模型與藥物早期安全性評價相結合，以便提高新藥研發的效率和安全性，降低新藥研發的成本，從而更好地推動藥物研發進程。

1 斑馬魚的生物學特點及其在藥物早期安全性評價中的優勢

在生命科學領域，斑馬魚（zebrafish，Danio rerio）作為一種常用的模式動物，正可以彌補體外細胞實驗和體內動物實驗的各種不足。斑馬魚與人類基因具有高達87%的同源性［2－3］，其信號傳導通路、生理結構與功能等均與哺乳動物高度相似［4］，這意味著用斑馬魚開展藥物實驗所得到的結果在多數情況下也適用于人體。同時，斑馬魚實驗是一個整體動物實驗，它能準確反映待測藥物在體內的吸收、分布、代謝及排泄等動態生理過程。所以，利用斑馬魚進行藥物早期安全性評價時，其結果比體外細胞實驗更可靠。

斑馬魚是一種小型的熱帶魚類，對生存的水環境要求不高，培養水的pH值在6.8～7.8之間、水溫25～31℃。斑馬魚卵徑約為1～1.5 mm，幼魚體長約1～4 mm，成魚體長約3 cm，體呈紡錘形，稍側扁，體側從頭至尾遍布藍色條紋。斑馬魚飼養成本低，繁殖周期短，孵出后約3個月可達到性成熟，5個月可到達體成熟。一年四季均可產卵，雌魚每次產卵可多達200～300枚。斑馬魚體外受精、體外發育、胚胎透明且發育快速，胚胎在24 h內即可發育成型。體外受精約120 hpf（hours post fertilization，受精后小時）后，各個組織和器官，例如腦、心臟、肝臟、腎臟、胰臟、肌肉和神經系統等均可發育完全。斑馬魚胚胎和出膜后約7 dpf（days post fertilization，受精后天數）的幼魚均可以依靠卵黃獲取營養，氧氣或水中的小分子物質可以通過膜或是皮膚進入斑馬魚體內［5］。斑馬魚的以上特點均顯示，與其他模式動物相比，利用斑馬魚進行體內藥物安全性評價，具有以下優勢：藥物用量少，給藥方便、便于觀察和操作、藥物篩選周期縮短、實驗成本低以及可實現高通量篩選，同時還方便對藥物的毒性機理進行研究。斑馬魚幼魚是目前為止唯一適合微孔板高內涵、高通量和全自動化分析的脊椎動物模型。除此之外，在以動物模型為研究對象進行藥物安全性評價時，研究人員需要充分考慮動物保護條例等問題，但人們通常不將受精120 hpf前的斑馬魚胚胎看成是動物個體［6］，因此從這一角度看，在藥物早期安全性評價實驗中，斑馬魚與嚙齒類模式動物相比，也具有明顯優勢。

由于斑馬魚具有以上多種優勢，引起了生物技術與制藥領域的高度關注，并且已被廣泛應用到藥物臨床前安全性評價當中。20世紀七、八十年代，世界上只有少數幾家實驗室發現斑馬魚可以作為模式動物應用于生物研究。隨后，由于研究人員發現斑馬魚與哺乳動物的發育進程、基因調控模式等均高度保守，所以斑馬魚日益受到生物制藥領域的關注，并被逐步應用于藥物早期安全性評價當中。目前，斑馬魚已被列為繼人和小鼠之后的第三大模式生物，其基因組的多種遺傳標記與基因芯片已經商品化。歐洲斑馬魚藥物篩選技術服務公司于2009年獲得了美國食品和藥品管理局（FDA）和歐洲藥品評估局（EMEA）的GLP認證，這標志著斑馬魚藥物毒理學與安全性評價模型已經得到了歐美國家政府的正式認可。目前，斑馬魚模型已被廣泛應用于一系列的藥物安全性評價當中，美國和歐洲共有約2 000多家機構從事斑馬魚相關的基礎及應用基礎性研究，有9家斑馬魚新藥篩選公司已面向全球范圍提供商業化服務［7］。斑馬魚模型已被廣泛應用于包括一般毒性評價、發育毒性評價、神經毒性評價、靶器官毒性評價、生殖毒性評價和局部毒性評價等在內的一系列藥物毒性和安全性評價當中。

2 斑馬魚模型在一般毒性評價中的應用

一般毒性評價包括急性毒性評價和長期毒性評價兩部分。急性毒性指實驗動物24 h內單次或是多次大劑量給予某種藥物所表現的有害作用。早在1984年，經濟合作發展組織（OECD）的指導手冊就已經將斑馬魚列為實驗的標準魚類，并應用于化合物的急性毒性檢測。長期毒性則指實驗動物連續多日接觸較大劑量的藥物所引起的中毒效應。藥物的一般毒性評價可以在斑馬魚的不同發育階段分別進行。將待測藥物分別定量、定時作用于斑馬魚的胚胎、幼魚和成魚期，隨后可以在顯微鏡下直接觀察卵黃囊水腫情況、卵凝結情況、色素形成、尾巴部延展和體節形成等，并且統計孵化率、致畸率、死亡率和LD50等數據，同時還可以記錄斑馬魚主要畸形特征［8－9］。根據已有數據顯示，利用斑馬魚胚胎檢測非致畸化合物的成功率可達75%，檢測致畸化合物的成功率更是高達100%［10］。

3 斑馬魚模型在發育毒性評價中的應用

斑馬魚胚胎透明，體外發育，最早即是作為模式生物應用于發育遺傳學領域。自20世紀50年代開始，Hisaoka等［11］即開始將斑馬魚應用于毒理學研究領域，并且發現巴比妥酸和二乙巴比妥酸等均會影響斑馬魚的正常發育。在斑馬魚的整個發育過程中，其很多器官和系統，例如心血管、肝臟、腦、腎臟和軟骨等的形成過程均對藥物的介入非常敏感，并且極易產生畸形。斑馬魚在心血管有嚴重畸形的情況下還可以存活并繼續發育較長時間，所以是評價藥物發育毒性的有效模型之一。1996年，歐洲經濟合作與發展組織（OECD）將斑馬魚胚胎檢測技術列為測定單一化學物毒性的標準方法之一，并且制定了詳細的操作指南［12］。利用斑馬魚對藥物發育毒性進行評價時，在加藥處理斑馬魚胚胎后，結合活體染料、抗體、熒光示蹤等方法，研究者可以直接觀察原腸期的血液循環、心跳、腦區形成、體軸形成和細胞運動等胚胎發育事件。

4 斑馬魚模型在神經毒性評價中的應用

斑馬魚的神經傳導系統非常敏感［13－15］，其大腦整體構造和血腦屏障的結構與功能均與哺乳動物相似［16－18］。在胚胎發育早期，斑馬魚的血腦屏障即開始起作用［19］。研究發現，許多在人體中具有神經毒性的化合物在斑馬魚身上同樣起作用。例如維甲酸可導致神經元氧化和凋亡，酒精可引起視神經和運動神經缺陷，新霉素可導致神經元凋亡等。Baraba等發現，驚厥誘導劑——戊四唑會導致斑馬魚痙攣，并且其作用于斑馬魚后，斑馬魚的電圖變化、行為變化和分子水平改變均與嚙齒類動物痙攣模型相似［7］。

傳統的利用哺乳動物來評價神經毒性的方法包括行為學分析、神經組織病理學分析和生物化學分析等，這些方法均費時費力。斑馬魚的神經系統在短時間內即可發育成熟，例如斑馬魚胚胎發育至24 hpf時，原代的神經元細胞就開始分化，48 hpf時腦室形成，隨后到6 dpf時，斑馬魚的整個神經系統已經形成。所以利用斑馬魚可以對藥物的神經毒性進行快速、有效地評價。研究藥物神經毒性時，斑馬魚胚胎加藥處理后，利用微分干涉相差顯微鏡或特殊染色方法可以直接在體內觀察特定神經元和神經突的改變［20］。通過胚胎整體原位雜交、免疫熒光和特羅蘭染色等方法，還可以評價藥物對斑馬魚髓鞘、運動神經元、多巴胺能神經元和視神經元等的作用。由于斑馬魚具有學習、睡眠和藥物成癮等神經性行為［21－26］，所以可以通過行為學分析對斑馬魚神經元的功能進行研究。斑馬魚胚胎或是幼魚的行為學分析可以在多孔板中進行［27－28］，便于觀察和操作。

5 斑馬魚模型在器官毒性評價中的應用

斑馬魚的各內臟器官在基因水平上與人類具有87%的同源性，各個器官在解剖和分子水平上也已經證實與哺乳動物具有一定相似性［23］。盡管斑馬魚缺少肺循環，但是比較轉錄組學分析顯示，斑馬魚的魚鰾與哺乳動物的肺之間具有同源性。因此斑馬魚是一種非常理想的藥物器官毒性評價模型［29］。

5.1 心臟毒性評價

心臟是斑馬魚第一個發育并發揮重要功能的器官。心肌收縮、心率和外觀形態等均是心臟功能的重要參數指標。由于斑馬魚胚胎和幼魚透明，因此研究人員均可以在活體斑馬魚上對以上各指標進行實時觀察研究。借助微電極，研究人員還可以同時記錄斑馬魚的復合動作電位［30］。統計斑馬魚心跳頻率時，可以將活體胚胎或是幼魚麻醉，然后通過人工計數或是錄像記錄等方法來進行［31－33］。受精后5 d的斑馬魚胚胎可以通過非侵入的方式進行心電圖檢測，從而了解其心肌是否缺血，心室是否肥厚［34］。

許多研究已表明，在人體中可影響心臟功能的藥物大多也可對斑馬魚心臟造成相似影響［33，35－41］。例如特非那定和氯米帕明等藥物，可以造成人體心律失調和負性肌力效應，同樣也可以引起斑馬魚心臟收縮性降低、心跳過緩、循環減緩等。心臟QT間期代表了心室除極和復極全過程所需的時間，其長短與心率的快慢密切相關。人體QT間期延長大多數表現為尖端扭轉型心動過速，嚴重時可誘發室性心律失常甚至猝死。因此在新藥研發過程中，藥品是否會造成心臟QT間期延長，是一個非常關鍵的問題。研究表明，藥物導致的心臟QT間期延長是由于hERG鉀離子通道阻斷所造成的。在斑馬魚中也存在著類似的zERG基因［37，41－42］。許多在人體上引起QT間期延長的藥物均能造成斑馬魚心律失常和心動過緩。Abbott研究室利用斑馬魚胚胎作為研究對象進行體內試驗，結果表明，幾乎所有已知的可造成心臟QT間期延長的藥物，均可以造成斑馬魚胚胎心室率和心房率不一致［32］。以上研究均表明，斑馬魚是一種理想的評價新藥心臟毒性的模式生物。

5.2 腎臟毒性評價

斑馬魚的腎臟稱為原腎，結構簡單，由一對腎單位、兩個腎小球和前腎小管組成。斑馬魚胚胎發育至40 hpf時，其前腎即具備血液濾過功能［43］，發育至96 hpf時，斑馬魚的腎臟濾過超微結構亦發育完全，至此，斑馬魚的腎臟功能完全成熟。斑馬魚腎小球由毛細血管內皮細胞、足細胞和極性管狀上皮細胞構成，這一點與高等脊椎動物非常相似［43］。盡管斑馬魚的前腎結構較為簡單，但是加藥處理后，其在腎臟損傷的表型方面與哺乳動物非常類似，例如對腎毒性藥物——慶大霉素相當敏感。研究表明，發育到50～54 hpf的斑馬魚心臟靜脈竇注射慶大霉素后，會引發嚴重的形態異常和腎臟系統功能異常，具體表現為心包和顱內水腫、腎小球濾過率降低等［44－45］，這一表型類似于慶大霉素造成的哺乳動物腎中毒現象［46］。當利用順鉑或是嘌呤霉素等腎毒性藥物處理斑馬魚幼魚時，與高等脊椎動物相似，同樣會造成腎臟損傷［47］。由于斑馬魚在腎臟損傷方面的表型與人類非常類似，所以以其作為動物模型，可以對藥物的腎臟毒性進行安全性評價。

5.3 肝臟毒性評價

肝臟是斑馬魚最大的腺體，斑馬魚發育到48 hpf時，肝臟形態基本形成，至72 hpf后，斑馬魚肝臟的形態和功能全部發育完全［48］。在斑馬魚肝臟中，存在多種與哺乳動物同源的脂質代謝酶，包括HMG-CoA合成酶、HMG-CoA裂解酶和氧化物酶體增殖物激活受體家族的各個成員等［49］。傳統的肝臟毒性評價包括肝臟排泄功能檢測、組織病理學檢測、血清酶檢測、肝臟細胞色素P450檢測、肝臟特異標記物表達檢測和肝細胞凋亡檢測等。由于斑馬魚與哺乳動物對外源化學物質的防御機制類似，均為酶的誘導和氧化應激，且作用機制也類似［50－51］；同時斑馬魚中含有94種細胞色素P基因，其中18種基因與哺乳動物同源［52］，所以利用斑馬魚評價待測藥品肝臟毒性時，同樣可以使用上述傳統的肝臟毒性檢測指標。研究表明，氨基甲酸酯具有哺乳動物肝臟毒性，將該化合物作用于斑馬魚，其產生的毒性效應與哺乳動物類似［48］。2013年，He等［53］利用6種已知的具有哺乳動物肝臟毒性和2種不具有肝臟毒性的藥物分別處理斑馬魚后，檢測斑馬魚卵黃囊停滯、肝臟細胞凋亡和肝臟形態改變等情況，發現斑馬魚對藥物肝臟毒性檢測的準確率高達100%。

5.4 胃腸毒性評價

斑馬魚的胃腸系統與人類差異較大，沒有胃，食道較短，腸道緊隨其后。Ng等［54］研究發現，斑馬魚胚胎發育至26～126 hpf后，其腸道的管腔形成，并不斷生長，內胚層分化形成了有功能的腸道上皮。在未喂食時，斑馬魚胚胎的腸道即開始游走性蠕動。由于斑馬魚早期體外發育，全身透明，所以其胃腸蠕動均可直接觀察。研究表明，氯丙嗪和異丙腎上腺素等可使斑馬魚腸腔擴增［5］。因此，利用斑馬魚研究藥物胃腸毒性時，可通過直接統計胃腸蠕動次數來完成。

5.5 耳毒性評價

哺乳動物的耳通常由外耳、中耳和內耳三部分組成。與此不同，斑馬魚只具有內耳。雖然從解剖學上看，斑馬魚的耳與哺乳動物具有明顯的不同。但是耳中的聽覺感受器——毛細胞在斑馬魚和哺乳動物中卻具有高度的相似性［57］。聽覺毛細胞是一種聽覺轉換器，可以將外界的聲音刺激轉化成電信號，最終產生聽覺。斑馬魚側線上的神經丘在結構和功能上即相當于人類的聽覺毛細胞。聽覺毛細胞的發育受到多種基因的調控，在斑馬魚和哺乳動物體內，這些基因均具有高度的同源性［58］。人類的聽覺毛細胞是一種終末分化細胞，一旦受損，不能再生，而斑馬魚幼魚的神經丘卻可以再生［59］。

斑馬魚胚胎時期，神經丘在光鏡下清晰可見。利用DASPEI或是FM1-43活體染色技術，可以直接觀察斑馬魚神經丘毛細胞的數量、完整性及其功能［60－61］，方便研究待測藥物對聽覺毛細胞的毒性影響。除此之外，還可以通過聽覺刺激驚嚇反應來研究藥物對斑馬魚聽力的影響。研究表明，發育至7 dpf的正常斑馬魚受到聲音刺激時，其自發活動明顯提高［62］。許多在人類身上具有耳毒性的藥物，例如新霉素、慶大霉素和奎寧等，均可以導致斑馬魚神經丘的丟失，從而造成其聽覺障礙［60，63－65］。DMSO已被證實可以加劇順鉑造成的斑馬魚幼魚聽覺毛細胞死亡［66］。以上研究均說明，斑馬魚是一種評價藥物耳毒性的理想動物模型。

5.6 視毒性評價

斑馬魚胚胎期的視覺系統發育非常迅速，5 dph的斑馬魚幼魚即具有非常成熟的視覺系統和視覺介導的行為。同時，斑馬魚還具有與人類相似的錐形視網膜和色彩視覺［67］。因此，可以利用斑馬魚對藥物的視覺毒性進行評價。研究人員通常采用眼動反應和視動反應對斑馬魚的視覺功能進行分析。眼動反應和視動反應均屬于視覺刺激誘發性行為，無需訓練即可誘導產生，人類亦具有以上兩種反應［68］。因此，可將待測藥物處理斑馬魚，然后利用眼動反應和視動反應對斑馬魚的視覺功能進行檢測，從而對藥物的視覺毒性進行安全性評價。2008年，Richards等［69］以斑馬魚作為動物模型，通過檢測視動反應，對27種化合物進行了視毒性評價。結果顯示，與體內、體外及臨床數據相比，其檢測的準確性高達70%。

6 斑馬魚模型在生殖毒性評價中的應用

生殖毒性通常是指藥物對雄性或是雌性個體生殖功能的損害，及其對后代的有害影響。嚙齒類動物是一種常用的評價生殖毒性的動物模型，但是其花費昂貴，并且實驗周期較長。與此不同，斑馬魚發育較快，受精72 h后即完成孵化，并且孵化后3個月內可達到性成熟，成年斑馬魚的繁殖周期一般只有7 d左右，并且雌性斑馬魚一次產卵可多達200個［5］。因此，利用斑馬魚對藥物的生殖毒性進行評價既經濟又快速。斑馬魚在早期胚胎和幼魚的發育過程中，原始的性腺均相同，沒有性別分化并且具有雙向發育潛能。許多外界因素，例如光照、溫度和pH值等均能影響并改變其遺傳性別［55］。

性腺指數（GSI）是一個常用的評價斑馬魚性腺功能的生物指標，主要指斑馬魚性腺與體重的比。性腺指數下降表示斑馬魚的垂體、下丘腦或是性腺活性降低。對于性成熟的雌性和雄性斑馬魚而言，產卵量和精子活力及密度分別是評價其生殖能力的常用指標。研究表明，17β雌二醇和鉛等均能抑制成年雌性斑馬魚的產卵量，并且產卵量與17β雌二醇之間具有明顯劑量依賴效應。鄰苯二甲酸二丁酯和壬基酚等會導致斑馬魚精子數量減少、激活率降低、精子壽命及劇烈活動時間縮短［55］。在性成熟的脊椎動物血清中，存在一種雌性特有的血清蛋白——卵黃蛋白原（vitellogenin，VTG），該蛋白的合成受到激素嚴格控制。卵黃生成期的雌性斑馬魚可分泌雌激素，進而誘導卵黃蛋白原的產生［56］。研究表明，雄性斑馬魚也存在VTG基因，在雌激素或是類雌激素的誘導下，雄性斑馬魚也可以合成卵黃蛋白原［55］。將待測藥品作用于斑馬魚，然后檢測雄魚、幼魚及非卵黃生成期雌性斑馬魚體內卵黃蛋白原水平的改變，可以作為評價藥物生殖毒性的一個靈敏而可靠的方法。許多藥物除了直接對親代斑馬魚的生殖系統造成損傷外，還有可能影響其子代的正常生長發育。因此利用斑馬魚對藥物的生殖毒性進行評價時，通常還需對子代胚胎的孵化率、畸形率等進行分析。

7 結語

利用斑馬魚模型對新藥進行早期安全性評價，其明顯優勢是可以提高藥物早期毒性預測的可靠性和靈敏度，縮短新藥研發周期，降低新藥研發成本，提高新藥研發的成功率。但該模型也存在著一些不足，由于給藥方式主要是將藥物溶解于培養水中，藥物通過滲透的方式進入斑馬魚體內，因此藥物的理化性質尤其是在水中的溶解性與分子量對結果影響較大，存在著假陽性和假陰性的現象，一些脂溶性強和分子量大的藥物目前尚不適合采用該模型進行快速評價。隨著生物技術的飛速發展，結合納米技術、脂質體技術等醫藥新技術，斑馬魚在藥物早期安全性評價中的應用技術也將進一步完善、成熟和規范。作為21世紀藥物早期安全性快速評價的新模型，斑馬魚必將憑借自身優勢，在新藥研發領域發揮更大的作用。

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Application of zebrafish model in early drug safety assessment

LIU Ke-chun，SUN Chen，WANG Xi-min，HOU Hai-rong
（Biology Institute，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China）

The construc tion of economical and effec tive early drug safety assessment technology has become g lobal urgent requirement in drug research anddevelopment area．Zeb rafish，one of three common model animals，is an ideal drug early safety assessmentmodel．New drug safety assessmentw ith the model can imp rove reliability andsensitivity of early drug toxicity prediction，reduce new drug research anddevelopment periodandcost，andimp rove success rate of drug research anddevelopment．We survey the app lication of zebrafish model in early drug safety assessment，such as general toxicity assessment，g row th toxicity assessment，neurotoxicity assessment，organ toxicity assessment，andrep roductive toxicity assessment，etc．With the development of biological and medicine technology，zeb rafish will play a more important role in early drug safety assessment area，and promote drug research and development process．

zeb rafish；early drug safety assessment；toxicity evaluation

R965.3

A

1002-4026（2014）05-0001-08

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.05.001

2014-08-21

國家自然科學基金青年基金（31400979）；山東省科技發展計劃（2001GHY11505；2013GHY11516）

劉可春（1964－），男，博士，研究員，研究方向為藥物篩選。Email：hliukch＠sdas.org