微生物吸光值法定量檢測實驗

陳杰+++張振遠

摘 要：通過對鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室提供的巴氏芽孢桿菌的培養(yǎng)，分別取相同菌量1ml菌懸液（OD600=1.0440），按相應(yīng)體積倍數(shù)稀釋后，測定各OD600值。數(shù)據(jù)的擬合發(fā)現(xiàn)，全部稀釋倍數(shù)乘冪關(guān)系擬合線擬合度不高，OD600值大于1或小于0.2時，越靠近坐標軸，數(shù)據(jù)越失真，誤差越大。截取0.2～1.0之間的OD600值，擬合乘冪曲線為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976），應(yīng)用簡單倍數(shù)關(guān)系y=1.044/x換算，兩者誤差都維持在5%之內(nèi)。OD600值在0.2～1.0之間運用簡單倍數(shù)關(guān)系換算準確、快捷。

關(guān)鍵詞：菌量；快捷；最優(yōu)區(qū)間；倍數(shù)關(guān)系

1 引言

微生物在人類生產(chǎn)生活中體現(xiàn)的特殊優(yōu)勢早已出現(xiàn)，如污水治理中重金屬離子的細菌吸附[1]、礦業(yè)工程的生物浸出[2]、巖土工程的生物固化[3-4]等等，微生物已成為國內(nèi)外研究的熱點。

在研究微生物的過程中，對微生物量的測定是必須的一個過程。測定微生物生長的方法很多，可分為直接法和間接法兩大類。直接法有粗放的測體積法（在刻度離心管中測沉降值）和精確的稱干重法。間接法有比濁法和生理指標法[5]。比濁法是實驗室中經(jīng)常使用的一種方法，用分光光度計選定一定波長（450nm～650nm），對微生物懸浮液進行吸光度的測定[6]。比濁法適用范圍廣，測量值在一定的區(qū)間內(nèi)比較準確、可靠[7]。

采用比濁法測定的OD值，與細菌的濃度在一定范圍內(nèi)是呈現(xiàn)著正比例的關(guān)系[8]。實驗室中經(jīng)常會遇到菌懸液稀釋的問題，稀釋后的菌懸液OD值和初始的懸液OD值的關(guān)系卻也不是簡單的倍數(shù)關(guān)系，而是呈現(xiàn)出一種乘冪關(guān)系[9]。較高的初始OD值需要稀釋且較低的OD值需濃縮后才能用于測定，而不能直接測定以防止檢測結(jié)果的不準確性，出現(xiàn)較大的誤差甚至是錯誤[10]。

為此，準確測定細菌菌液濃度，了解在一定OD值范圍內(nèi)，稀釋倍數(shù)與稀釋OD值的關(guān)系及準確快速進行菌量比較的方法在對實驗數(shù)據(jù)的相關(guān)換算方面有著一定的意義。

2 材料和方法

2.1 儀器設(shè)備

AL 104電子天平、VB-40高壓滅菌鍋（德國systec）、SW-CJ-1FD潔凈工作臺、小容量恒溫高速培養(yǎng)振蕩器搖床（SHP-200D）、微量冷凍離心機（5415R Germany）、蛋白核酸測定儀（biophotometer eppendorf Germany）、pHS-3C酸度計、eppendorf移液槍

2.2 菌種

保存在超低溫冰箱的巴氏芽孢桿菌單一菌株，菌種由鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室提供。

2.3 細菌培養(yǎng)

培養(yǎng)基成分為酵母提取物20g/L、氯化銨10g/L及去離子水，pH調(diào)至8.5，過濾滅菌器經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，放置潔凈工作臺對培養(yǎng)基進行過濾滅菌。每100ml培養(yǎng)液放置在250ml錐形瓶中，母液（OD600值1.500）1：100接種，放置搖床中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r/min。

2.4 細菌懸液制備

放置搖床8h后，取出菌液。取30支2ml的離心管，1000μL移液槍準確移取菌液，每離心管1ml。30支離心管分A、B兩批，每批15支，分別放置于離心機中，轉(zhuǎn)速10000rpm，溫度4℃，離心10分鐘，離心后吸除上清液，用2ml生理鹽水沖洗細菌，再次離心。重復(fù)沖洗離心一次。分別將離心之后的細菌用生理鹽水稀釋成0.3ml、0.4ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml。

2.5 OD600值的測定

以生理鹽水為空白樣，用蛋白核酸測定儀測定各樣品OD600值。

3 實驗結(jié)果與討論

實驗記錄數(shù)據(jù)如表1。

截取OD600值0.2～1的數(shù)據(jù)，乘冪關(guān)系擬合圖為圖2。

圖1對于全部稀釋倍數(shù)（0.3～12.5），用乘冪關(guān)系擬合后，擬合程度不高（R2=0.9258<0.95），在0

圖2截取OD600值0.2～1的數(shù)據(jù)，乘冪關(guān)系擬合，R2=0.9976。原始數(shù)據(jù)帶入擬合公式y(tǒng)=1.0764x-1.0115（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)），分別得出y1～y5及所對應(yīng)的誤差δ1～δ5（如表2）。最大誤差為δ4.5=4.10%，最小誤差為δ3=0.56%，對實驗數(shù)據(jù)的換算具有較高的準確性，且能達到99.44%。

實際的菌液稀釋換算中簡單的倍數(shù)關(guān)系更加的快捷易于把握，用公式y(tǒng)=1.044x-1（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)）換算，分別得出y'1～y'5及所對應(yīng)的誤差δ'1～δ'5（如表2）。最大誤差為δ'1.5=5.33%，最小誤差為δ'4=0.80%，在0.2

兩次換算結(jié)果數(shù)據(jù)如表2。

從表2中對比得出：OD600值在1～0.2區(qū)間上，兩種換算關(guān)系結(jié)果的誤差維持在5%的水平，具有較高的精確度，而超過這一范圍即OD600值在大于1或者小于0.2時，越靠近坐標軸任意兩種換算的結(jié)果誤差就越大，失去了換算的指導(dǎo)意義。菌懸液稀釋曲線呈現(xiàn)的是乘冪關(guān)系和徐風[9]等人的結(jié)論一致。簡單的倍數(shù)關(guān)系曲線更易于換算和把握，與陶海靜[11]的結(jié)論相似。實際應(yīng)用過程中，在特定的范圍內(nèi)（OD600值在1～0.2之間），將高濃度的菌懸液稀釋到此區(qū)間，用簡單的倍數(shù)換算就可以得到較為精確的換算值，方便于不同菌懸液菌量的比較。

4 結(jié)論

（1）菌懸液稀釋倍數(shù)與稀釋OD600值不是呈現(xiàn)出簡單的倍數(shù)關(guān)系，而是區(qū)間性的乘冪關(guān)系或是區(qū)間性的簡單倍數(shù)關(guān)系。

（2）此菌懸液稀釋值處在0.2～1.0之間，液稀釋倍數(shù)與稀釋OD600值的乘冪關(guān)系公式為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)），同樣在此區(qū)間內(nèi)滿足簡單倍數(shù)關(guān)系y = 1.044/x（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)）。

（3）實驗室中測定菌懸液OD600值應(yīng)處在0.2～1.0之間，應(yīng)用簡單的倍數(shù)關(guān)系換算，準確度達到95%，提高了實驗數(shù)據(jù)的準確性及比較換算的快捷性。

參考文獻

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[7]莫繼先，王志剛，王昌河.常見微生物數(shù)量測定方法比較[J].生物學(xué)教學(xué)，2012，01：42-43.

[8]李冬陽，茹柿平，吳堅等.分光光度法快速檢測細菌[J].分析化學(xué)，2010，04：573-576.

[9]徐鳳，雷萍.菌懸液稀釋倍數(shù)與OD_（600）的關(guān)系實驗[J].環(huán)保科技，2010，03：43-45.

[10]唐翠明，王振江，鄺哲師，等.桑樹青枯病菌紫外分光度計菌方法的研究[J].廣東蠶業(yè)，2008，03：42-44.

[11]陶海靜.雞大腸桿菌計數(shù)方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007， 27：8504-8504+8516.

*作者簡介：陳杰（1989，10-），男，湖南華容人，南華大學(xué)核資源工程學(xué)院采礦工程碩士研究生，研究方向為微生物巖土工程。endprint

（2）此菌懸液稀釋值處在0.2～1.0之間，液稀釋倍數(shù)與稀釋OD600值的乘冪關(guān)系公式為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)），同樣在此區(qū)間內(nèi)滿足簡單倍數(shù)關(guān)系y = 1.044/x（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)）。

（3）實驗室中測定菌懸液OD600值應(yīng)處在0.2～1.0之間，應(yīng)用簡單的倍數(shù)關(guān)系換算，準確度達到95%，提高了實驗數(shù)據(jù)的準確性及比較換算的快捷性。

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*作者簡介：陳杰（1989，10-），男，湖南華容人，南華大學(xué)核資源工程學(xué)院采礦工程碩士研究生，研究方向為微生物巖土工程。endprint

（2）此菌懸液稀釋值處在0.2～1.0之間，液稀釋倍數(shù)與稀釋OD600值的乘冪關(guān)系公式為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)），同樣在此區(qū)間內(nèi)滿足簡單倍數(shù)關(guān)系y = 1.044/x（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)）。

（3）實驗室中測定菌懸液OD600值應(yīng)處在0.2～1.0之間，應(yīng)用簡單的倍數(shù)關(guān)系換算，準確度達到95%，提高了實驗數(shù)據(jù)的準確性及比較換算的快捷性。

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*作者簡介：陳杰（1989，10-），男，湖南華容人，南華大學(xué)核資源工程學(xué)院采礦工程碩士研究生，研究方向為微生物巖土工程。endprint