UHPLC-MS/MS同時測定大鼠血漿中 6 種木脂素類成分及其藥代動力學研究

王 青， 王 瑩， 宋小妹， 張偉東， 王鵬遠， 顧 宜， 王曉娟*

（1.陜西國際商貿學院， 陜西 咸陽 712046； 2.第四軍醫大學口腔醫院藥劑科， 陜西 西安 710032；3.陜西中醫學院藥學院， 陜西 咸陽 712046）

［制 劑］

UHPLC-MS/MS同時測定大鼠血漿中 6 種木脂素類成分及其藥代動力學研究

王 青1， 王 瑩2， 宋小妹3， 張偉東2， 王鵬遠2， 顧 宜2， 王曉娟2*

（1.陜西國際商貿學院， 陜西 咸陽 712046； 2.第四軍醫大學口腔醫院藥劑科， 陜西 西安 710032；3.陜西中醫學院藥學院， 陜西 咸陽 712046）

目的 建立 利 用 UHPLC-MS/MS 法 同 時 測定 大 鼠 血 漿中 Gomisin D、 Gomisin E、 五味 子 醇 甲、 五 味 子 甲 素、Gomisin R和五味子乙素 6 種木脂素的分析方法， 并研究大鼠灌胃給予五味子提取物后的藥代動力學特征。 方法 采用 Agilent Poroshell120 EC-C18色譜柱， 流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫， 采用電噴霧電離源 (ESI) ， 掃描方式為多反應離子監測 (MRM)。 結果 大鼠血漿中6 種木脂素成分的校正曲線線性關系良好， 日內、 日間精密度和準確度符合要求， 提取回收率 75.76% ～88.82%。 結論 該方法簡便、 快速、 靈敏、 穩定， 適用于五味子提取物的體內分析，為其進一步研究奠定基礎。

UHPLC-MS/MS； 大鼠血漿； 五味子； 木脂素； 藥代動力學

五味子是木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis(Turcz.)Bail1.的干燥成熟果實。習稱 “ 北五味子”。其味酸、甘，性溫。 有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心的功能，用于久嗽虛喘，夢遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，短氣脈虛， 內熱消渴， 心悸失眠等癥［1］。 五味子中含有多糖、 揮發油和木脂素 類成分［2-3］， 其中 木脂素類成分與五味子的抗肝臟損傷、抗氧化作用明顯相關［4］。五味 子 中木脂素類 成 分在體內代 謝 研 究，國內外文獻已有報道，主要為五味子中單一成分血藥濃度測定［5-8］或 分別與 黃芩、 丹參配伍后 對其成分在大鼠體內的藥代動力學影響［9-10］。 本實驗 采用UHPLC-MS/MS 法同時測定五味子提取物中 6 種木脂素類成分的血藥濃度，研究大鼠給予五味子提取物后的藥代動力學特征，為五味子在臨床上的合理應用提供理論依據［11］。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 Gomisin D、Gomisin E、五味子醇甲、五味子甲素、 Gomisin R、 五味子乙素 ( 中國科學院昆明植物研究所)； 尼莫地平 (Nimodipine， 批號 100270—200002， 中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、 甲醇 (色譜純， 美國 Fisher公司)； 水為實驗室自制三蒸水；其它試劑均為分析純。五味子提取物粉末購自西安昊軒生物制品有限公司，其中Gomisin D、 Gomisin E、 五味子醇甲、 五味子甲素、Gomisin R、 五 味 子 乙 素 含 有 量 分 別 為 0.222、0.008、 9.311、 0.816、 1.466、 2.040 mg/g。

1.2 儀器 1290—6460 型三重四極桿串聯質譜儀(美國 Agilent technology公司)， 配有電噴霧離子源(ESI) 及 MassHunter VersionB.04.10 工 作 軟 件；Agilent1290 Infinity超 高 效 液 相 色 譜 系 統， 配 有G4220A二元泵、 G1314E VWD檢 測 器、G1316C柱溫箱及 G4226A自動進樣器。

1.3 動 物 Sprague-Dawley大 鼠， 雄性， 體質量(300 ±20)g， 第四軍醫大學實驗動物中心提供，動物許可證號 SCXK(軍 2011025)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 ECC18(2.7 μm， 2.1 mm×100 mm)， 流動相為乙腈-0.1% 甲 酸 水 溶 液 梯 度 洗 脫， 體 積 流 量 0.4 mL/min，柱溫 35 ℃， 進樣量 1 μL。 梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相洗脫梯度Tab.1 Mobile phase gradients

2.2 質譜條件 采用電噴霧電離源 (ESI)； 掃描方式為多反應監測模式 (MRM) ； 噴霧氣壓 45 psi，霧化器溫度 350 ℃； 毛細管電壓正離子 4 kV， 負離子 3.5 kV；氣流流量 10 L/min。掃描時間為23min。用于定量分析的離子反應及質譜參數見表2。

表2 定量離子及質譜參數Tab.2 Quantitative ionand M ass spectrum parameters

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取 Gomisin D、Gomisin E、 五味子醇甲、 五味子甲素、 五味子乙素對照品 19.5、 0.785、 27.8、 3.09、 2.06 mg， 加甲醇溶解， 并定容至10mL量瓶中， 即為對照品貯備液①； 再分別取 對 照品貯備液 ①1mL及 Gomisin R對照品1.955mg，加甲醇溶解定容至50mL量瓶中，即為對照品貯備液②。

精密移取對照品貯備液②1 mL至 10 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 制成含量分別為 Gomisin D 3 900 ng/mL、 Gomisin E 157 ng/mL、 五味子醇甲5 560 ng/mL、 五味子甲素 618 ng/mL、五味子乙素412 ng/mL、 Gomisin R 39100 ng/mL的混合對照品溶液，搖勻，4℃保存備用。

2.3.2 內標溶液的配制 精密稱取尼莫地平對照品適量， 用甲醇溶解定容至10 mL量瓶中， 作為內標貯備液。精密量取內標貯備液適量，用甲醇配成2.176 μg/mL的內標溶液，4 ℃保存備用。

2.3.3 五味子提取溶液配制 準確稱取五味子提取物粉末 1.5 g，用生理鹽水 20 mL溶解混勻， 配成 0.075 g/m L的五味子提取物溶液。

2.4 給藥方案與樣品采集 健康雄性 SD大鼠 5只， 給藥前禁食12 h， 灌胃給予五味子提取物溶液2.0 mL/只 (相當于五味子提取物粉末 0.5 g/kg)。給藥后于 0、 5、10、 15、30 min 和 1、2、 3、 4、6、 8、12、 24 h 自眼底靜脈取血 0.5 mL置肝素化的 EP管中， 3 000 r/min 離心 10 min， 轉移上層血漿貯存于 -20 ℃。

2.5 樣品處理 精密吸取大鼠空白血漿 100 μL血漿中， 加入 10 μL尼莫地平渦旋混合 1 min， 加入100 μL甲醇渦旋混合 0.5 min， 再加入 300 μL乙腈渦旋混合 0.5 min， 12 000 r/min 離 心 10 min，取上清液 400 μL 45 ℃氮氣吹干，100 μL甲醇復溶， 高速離心后1μL進樣測定。

2.6 數據處理 應用 DAS 2.0 藥代動力學軟件求出藥代動力學參數。

2.7 測定方法的建立

2.7.1 方法的專屬性 空白血漿、 空白血漿加分析物標準品及給藥后的血漿樣品色譜圖見圖1。 結果顯示，空白血漿在與對照品對應的保留時間處沒有色譜峰，血漿內源性物質、代謝產物及其他成分均不干擾6個目標成分的檢出。

2.7.2 標準曲線及檢測靈敏度 精密吸取混合對照 品 溶 液0.125、 0.625、 1.25、 2.5、 5.0、10.0 mL， 分別置于 10 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 制得混合對照品系列液。取 100 μL空白血漿依次加入 10 μL內標液和 10 μL的混合對照品系列液， 渦旋混合 1 min， 按 “2.5” 項下處理， 1 μL進樣測定。以目標物和內標物的峰面積比Y對目標物濃度 X用加權最小二乘法進行回歸運算［12-13］。結果見表 3。 6 個成分的定量限 (LOQ) 分別為4.88、 0.21、 6.95、 0.77、 48.88、 0.52 ng/m L。

2.7.3 準確度與精密度 用空白血漿配制低、中、高3個質量濃度的質控樣品各5份，測得峰面積后帶入隨行標準曲線計算相應的藥物濃度，與理論值相比，計算方法的準確度；同一質量濃度每隔2 h測定1次，平行測定3次，計算日內精密度；每隔1 d測定 1次， 平行測定3次，計算日間精密度。結果見表 4。 日內精密度 RSD值小于 10%， 準確度在 89.71% ～98.82%之間， 日間精密度 RSD值小于 12%， 準確度在 90.58% ～98.74%之間， 均符合有關規范要求［14-15］。

2.7.4 提取回收率 用空白血漿配制低、 中、 高 3個質量濃度的質控樣品各5份，按樣品處理項下的方法進行處理。測得峰面積后與同濃度對照品溶液直接進樣所得峰面積進行比較，計算提取回收率。結果見表5。 結果顯示高中低質控樣品的提取回收率在 75.76% ～88.82%之間， RSD均小于 13%。

2.7.5 樣品穩定性實驗 配制低、中、高 3 個質量濃度的質控樣品各5 份， 貯存于 -20 ℃冰箱中，反復凍融3 次， 每次間隔24 h， 按樣品處理項下的方法進行處理后進樣測定，測得實際值均在理論值的 85.31% ～97.93%范圍波動，RSD＜14%， 表明樣品可以耐受3次凍融。低、中、高質量濃度質控樣品室溫放置 24 h， 在 -20 ℃冰箱中放置 30 d，測 得 實 際 值 在 理 論 值 的 85.07% ～96.65%，RSD＜12%； 樣品經處理后在自動進樣器中放置24 h 后， 測 定 實 際 值 在 理 論 值 的 85.05% ～96.01%， RSD＜13%， 均符合相關規定， 表明該 6種成分在血漿樣品中穩定性良好。

圖 1 空白血漿色譜圖 （A）， 加有混合對照品 （ Gom isin D、 Gom isin E、 五味子醇甲、 五 味 子 甲素、 Gom isin R、 五 味子乙素） 和 內 標的空白血 漿 色 譜圖（B）， 大鼠灌胃給藥 0.5 h后的血漿色譜圖 （C）Fig.1 Typical chromatograms of blank plasma （A）， spiked p lasma w ith reference subtances（Gom isin D， Gom isin、 schizandrol A、 schizandrin A、 Gom isin R、 and schizandrin B and the IS（ B） and plasma from rats at 0.5 h after administration（C）

表3 標準曲線及線性范圍Tab.3 Calibration curves and dynam ic range

表 4 準確度與精密度實驗結果 （n=5）Tab.4 Results of accuracy and precision（ n=5）

表 5 回收率實驗結果 （n=5）Tab.5 Results of recovery tests（n=5）

2.7.6 基質效應 取 6 份不同來源的大鼠空白血漿 100 μL， 按樣品處理項下的方法制得含尼莫地平內標液和低、中、高3個質量濃度的質控樣品；另取流動相代替空白血漿，制得與上述標準品相同系列濃度的混合標準品溶液和內標物溶液，測得的相應峰面積比值用于評價基質效應，結果其比值均在 85.29% ～101.99%之間， 表明大鼠血漿生物基質不影響樣品測定。

2.8 大鼠給藥后的藥代動力學 應用建立的 UHPLC-MS/MS 方法， 測定大鼠血漿藥物濃度， 各時間點平均藥-時曲線見圖 2。 各組藥代動力學參數見表 6。 由圖 2、 表 6 可知， 6 種成分中 Gomisin E及五味子乙素的 t1/2明顯較長， 表明此兩種成分的消除較慢。

圖 2 大鼠灌胃給予五味子提取物后的平均藥-時曲線 （n=5）Fig.2 M ean concentration-time curve of rats after oral adm inistration of schisandra extracts（n=5）

3 討論

本實驗采用 UHPLC-MS/MS 同時測定大鼠灌服五味子提取物后血漿中6種木脂素類成分的量，以尼莫地平為內標，采用正離子模式檢測。樣品預處理采用了甲醇-乙腈沉淀蛋白方法， 操作簡便， 血漿樣品只需 100 μL， 雜質不干擾測定， 具有良好的精密度和準確度，有較高的靈敏度和專屬性，重現性好，符合生物樣品分析方法要求，適合大批量樣品的分析測定。

實驗結果顯示， 6 種被測成分在 10 min 時即可檢測到且達峰時間除 Gomisin D外均較短，提示這幾種成分在胃部被很快吸收入血，與化合物結構差異有關；藥時曲線呈現雙峰，提示這6種成分在吸收過程中可能存在腸-肝循環、 腸-腸循 環或胃-腸循環。

本研究采用 UHPLC-MS/MS 系統建立了同時測定大鼠血漿樣品中6種木脂素類成分特異、靈敏、可靠的定量分析方法， 該方法較 HPLC顯著提高了定性分析的準確性以及定量分析的靈敏度，適于五味子的進一步藥代動力學研究。

表 6 大鼠灌胃給予五味子提取物后的藥動學參數 （n=5）Tab.6 Pharm acokinetics parameters of rats after oral adm inistration of schisandra extracts（n=5）

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Sim ultaneous determ ination of six lignans compounds in rat p lasm a and pharm acokinetics by UHPLC-MS/MS

WANG Qing1， WANG Ying2， SONG Xiao-mei3， ZHANGWei-dong2， WANG Peng-yuan2，GU Yi2， WANG Xiao-juan2*

(1.Shaanxi Instituteof International Tradeand Commerce， Xiangyang 712046， China； 2.Department of Pharmacy， Schoolof Stomatology， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， China； 3.School of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China)

AIM To establish a UHPLC-MS/MS analyticalmethod for simultaneous determination of six lignans compounds of Gomisin D，Gomisin E， schizandrol A， schizandrin A，Gomisin R and schizandrin B in rat plasma and to study the pharmacokinetic characteristics after oral administration of Schisandra Chinensis Fructus. M ETHODS Chromatographic separation was achieved on an Agilent Poroshell 120 EC-C18column， with gradient elution using amobile phase that consisted of acetonitrile-0.1%formic acid in water.Detetion was performed by a triple-quadrupole tandem mass spectrometer inmultiple reactionmonitoring(MRM)mode using the electrospray ionization technique.RESULTS The calibration curve of six lignans compounds showed a good linear relationship， the intra-and inter-day precisions and accuracy met the requirements and the extraction recovery ranged between 75.76% ～88.82%.CONCLUSION This established method is simple， rapid，sensitive and stable and applicable to the analysis of Schisandra Chinensis Fructus for its further study.

UHPLC-MS/MS； rat plasma； Schisandra Chinensis Fructus； lignans； pharmacokinetics

R284.1

:A

:1001-1528(2014)02-0266-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.011

2013-03-15

王 青 (1987—) ， 女， 碩士， 從事中草藥藥效物質基礎研究。 E-mail:709225603@qq.com

*通信作者: 王曉娟 (1962—) ， 女， 主任藥師， 從事天然藥物化學與中藥新制劑研究。 E-mail:wxjyh231@fmmu.edu.cn